CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE

1. CLASIFICAREA METODELOR CROMATOGRAFICE

Metoda cromatografica se bazeaza pe repartitia diferita a componentelor unui amestec intre o faza mobila si una stationara, avand ca urmare deplasarea, cu viteza diferita a componentelor purtate de catre faza mobila de-a lungul fazei stationare [47-50]. In functie de natura fazelor exista patru tipuri de metode cromatografice (tab.1.).

Tabelul 1. Clasificarea metodelor cromatografice functie de natura fazei mobile respectiv stationare.

In functie de aparatura implicata in procesul de separare cromatografica in cromatografia de lichide putem face distinctie intre cromatografia pe coloana inchisa (cromatografia de lichide de inalta performanta - HPLC) si cromatografia pe coloana deschisa. In cazul in care faza stationara este depusa pe o suprafata plana avem cromatografia plana (cromatografia pe strat subtire si cromatografia pe hartie).

2. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE

Necesitatea analizei compusilor cu greutate moleculara mare, instabili termic sau a compusilor biologici, fara efectuarea unor reactii auxiliare de derivatizare au impulsionat in mod hotarator dezvoltarea cromatografiei de lichide. In prezent se poate afirma ca din totalul amestecurilor de compusi naturali si sintetici, 80% pot fi separati si analizati prin cromatografia de lichide.

Cromatografia pe strat subtire este o tehnica simpla ca aparatura, care ne ofera posibilitati multiple de separare. Aceasta tehnica se mai numeste si cromatografia plana. In ultimul deceniu s-au inregistrat progrese insemnate atat in privinta fazelor stationare cat si a perfectionarii aparaturii de masurare. Aceasta dezvoltare a permis obtinerea unor limite de detectie de ordinul μg si chiar a pg in cazul unor compusi adecvati.

In cazul cromatografiei pe strat subtire nu exista ingradiri in privinta utilizarii unor solventi ca eluenti ce absorb in UV (de exemplu: toluen, acetona, acetat de etil etc.) si care prezinta selectivitati bune intr-o serie de separari. De asemenea nu exista limitari in privinta utilizarii unor reactivi pentru detectie sau identificare.

Principiul cromatografiei pe strat subtire

Cromatografia pe strat subtire este o tehnica foarte raspandita datorita simplitatii ei si posibilitatii de analizare a unor amestecuri complexe din punct de vedere calitativ si cantitativ.

Tehnica de lucru consta in aplicarea probei (solutiei), sub forma de spot sau banda la 1-2 cm de marginea inferioara a placii cromatografice, pe o linie imaginara numita linie de start. Probele pot fi aplicate automat sau manual cu microcapilare, micropipete sau microseringi. Placa cromatografica este formata dintr-o placa de sticla sau folie de aluminiu acoperita cu un strat subtire de adsorbent (silicagel, silicagel chimic modificat, alumina, celuloza microcristalina etc.). Dupa ce solventul in care a fost dizolvata proba s-a evaporat, placa este introdusa cu partea inferioara intr-o cuva ce contine solventul sau amestecul de solventi de developare. Developarea se poate realiza in camere normale (N) sau camere sanwich (S). Nivelul eluentului se va situa sub nivelul liniei de start. Eluentul migreaza de-a lungul placii cromatografice datorita fortelor de capilaritate, purtand cu viteze diferite componentii amestecului de analizat, fapt care se concretizeaza in separarea lor. Nivelul pana la care se ridica eluentul se numeste linie de front. Dupa ce frontul eluentului parcurge o anumita distanta (≈8cm) placa se scoate si se usuca. Vizualizarea se realizeaza prin pulverizare cu reactivi de culoare specifici.

Intr-un sistem dat faza stationara-faza mobila, fiecarui component ii corespunde o anumita valoare R_f :

Aceasta se defineste ca fiind raportul dintre distanta migrata de component h, masurata de la linia de start pana la centrul spotului si distanta migrata de eluent H, masurata de la linia de start pana la linia de front (fig.1.).

Figura 1. Marimi caracteristice cromatografiei pe strat subtire.

Marimea R_f ia valori intre 0 - 1. O valoare egala cu zero respectiv o distanta migrata nula semnifica o interactiune puternica intre component si faza stationara. In cazul in care marimea R_f ia valoarea 1 are loc o deplasare in front a componentului.

2.2. Procesul elementar de separare

Separarea cromatorafica a componentilor unei probe are loc ca urmare a echilibrelor ce se realizeaza la interfata faza mobila - faza stationara. Curgerea fazei mobile peste faza stationara se realizeaza in conditiile unei suprafete foarte mari a interferentei dintre cele 2 faze. Acest fapt se concretizeaza in multiplicarea echilibrelor intre cele 2 faze de un numar foarte mare de ori.

In functie de polaritatea relativa a fazei stationare fata de faza mobila avem:

cromatografie cu faze directe: cand faza stationara este mai polara decat faza mobila,

cromatografie cu faze inverse: faza mobila este mai polara decat faza stationara.

Procesul elementar de separare este dictat de interactiunile dintre cele doua faze. Astfel, daca faza stationara este silicagelul, iar faza mobila un solvent sau amestec de solventi organici nepolari, separarea are loc o printr-un prodes de adsorbtie-desorbtie a moleculelor solventului respectiv componentului. Utilizand aceeasi faza stationara, dar un solvent organic polar capabil de a forma punti de hidrogen (alcooli, acizi) sau amestecuri ai acestora cu diferite cantitati de apa, suprafata silicagelului se va imbraca cu un film de lichid, cu proprietati diferite de cele ale fazei mobile. In acest caz componentii se vor separa pe baza unui proces de repartitie intre doua faze lichide nemiscibile. Utilizand ca faza stationara silicagelul chimic modificat si ca faza mobila un solvent organic sau amestecuri fara apa procesul de separare va fi tot de repartitie. In cazul in care faza mobila contine apa, mecanismul de separare este unul special, bazat pe interactiuni hidrofobe.

FAZA STATIONARA

Alegerea unei anumite faze stationare presupune a gasi raspunsul la intrebarile:

Care sunt proprietatile compusilor probei?

Care ar fi cel mai potrivit mecanism de separare?

Pentru a raspunde la primul punct este necesar sa se cunoasca macar aproximativ structura substantelor de separat, respectiv polaritatea lor si masa lor moleculara [51,52]. Pentru substante nepolare se recomanda adsorbenti polari, alumina si silicagelul adecvate (cromatografie de adsorbtie); pentru substante polare se recomanda adsorbenti mai putin activi, silicagelul dezactivat cu apa sau chimic modificat, poliamida, celuloza etc., in timp ce substantele ionizabile se separa pe schimbatori de ioni. In cazul cand componentele sunt de aceeasi clasa, diferind foarte putin in ceea ce priveste natura gruparilor polare (serii omoloage) se prefera cromatografia de repartitie. Cand substantele din amestec difera prin natura gruparilor functionale sau prin structura se prefera cromatografia de adsorbtie. Cind substantele difera prin dimensiunea moleculelor se alege un material de strat care sa permita ecluziunea sterica in domeniul respectiv de mase moleculare sau se face uz de cromatografia prin precipitare.

In alegerea adsorbentului si a liantului trebuie sa se tina cont de metoda de vizualizare folosita. Ca materiale granulare pentru conofectionarea straturilor subtiri pot fi utilizate in principiu oricare din substantele solide putin solubile in eluentul utilizat, avand o granulatie suficient de mica pentru o adsorbtie suficienta, dar destul de mare pentru a se asigura o viteza de migrare rapida. Distributia granulometrica nu trebuie sa fie prea larga pentru a se realiza straturi uniforme.

Cea mai utilizata grosime a straturilor subtiri este de 0,25 mm si 0,3 mm, pentru scopuri analitice, iar pentru cele preparative se utilizeaza si straturi de 0,5 mm sau 1-2 mm si chiar mai groase. In scopuri analitice, au aparut o serie de placi cromatografice cu grosimea stratului si dimensiunea particulelor mult mai mici, cu performante ridicate in separarea probelor complexe - HPTLC. In ultima perioada in loc de straturile pe baza de granule s-au introdus straturile monolitice de silicagel -UTLC, caracterizate printr-o viteza mare de separare [53]. In tabelul 1.2. sunt prezentate comparativ cateva caracteristici cromatografice ale acestor placi.

Tabelul 2. Tipuri de placi cromatografice

Modificarile materialelor obisnuite de strat prin impregnare cu diverse substante sau chiar amestecuri de doua materiale se face numai atunci cand celelalte metode nu duc la rezultate potrivite, sau pentru a usura punere in evidenta a zonelor.

Pentru alegerea celor mai bune conditii de lucru, de cele mai multe ori, se recurge la schema data de Stahl (fig. 2.).

Triunghiul se aseaza cu un varf in dreptul proprietatii celei mai importante a probei, la celelalte 2 varfuri se citesc conditiile pentru faza stationara si faza mobila.

Figura 2. Schema lui Stahl pentru alegerea conditiilor potrivite pentru separarea prin cromatografie pe strat subtire de adsorbtie / repartitie.

Cele mai larg folosite faze stationare sunt silicagelul, silicagelul chimic modificat (C18) si alumina. Pe langa acestea se mai utilizeaza si poliamida, kiselgurul, oxidul de magneziu, florisit, geluri, etc.

1. Silicagelul

Silicagelul este in momentul de fata materialul de strat cel mai des folosit datorita faptului ca poate fi utilizat pentru toate tipurile de componenti: acizi, bazici, neutri, polari si nepolari. Proprietatile unui sort de silicagel cromotografic depind de: compozitia granulometrica, suprafata specifica, puritate, diametrul mediu, forma si distributia porilor, precum si de procentul de apa continut in strat. Silicagelul are in mod obisnuit un pH acid, dar de obicei acesta este corectat la PH ≈ 7. Se utilizeaza in practica si silicageluri acide sau bazice.

Dupa Stahl, silicagelul utilizat in cromatografia pe strat subtire trebuie sa aiba granulatia cuprinsa intre 10 - 40 μ.

O alta caracteristica de baza a silicagelului este structura poroasa, care determina atat marimea suprafetei cat si mecanismul de separare. Astfel, daca porii sunt fini, suprafata va fi mai mare, incat in cazul moleculelor mici se va obtine o rezolutie mai buna. Componentele cu molecule mari vor fi separate mai bine pe silicagelul cu pori mari.

Suprafata specifica a silicagelului utilizat in cromatografia pe strat subtire poate avea valori foarte diferite, intre 10 m²/g pana la 1000 m²/g in functie de componentele de separat. Cele uzuale pentru cromatografie cu suprafata specifica intre 300-600 m²/g.

Silicagelul activat nelegat, este privit ca cel mai polar adsorbant disponibil, prezentand ca interactiune principala interactiunea polara iar ca interactiune secundara cea de schimb cationic. Particulele de silicagel pot fi privite ca si polimeri ai acidului silicic, constand din tetraedre de SiO₄ legate. Activitatea suprafetei de silicagel a fost exprimata in mai multe moduri :

prin intermediul gruparilor OH legate de scheletul de SiO₂ ;

datorita apei adsorbite pe suprafata SiO₂.

S-a aratat ca, grupele silanol de pe suprafata silicagelului sunt centrii pe care se adsorb, prin intermediul puntilor de hidrogen, apa si multe alte molecule organice polare ce contin oxigen. A fost demonstrat ca pe suprafata silicagelului exista grupari OH care prezinta un caracter mai acid decat gruparile OH ale silanilor alifatici. Proprietatile gruparii OH sunt dependente de modul lor de distributie. Pe suprafata, oxigenul poate fi sub forma gruparilor silanol (Si-OH) sau a puntilor siloxanice (Si-O-Si). In functie de reactivitatea lor grupele silanol pot fi clasificate in grupe izolate, cand atomul de siliciu are trei legaturi in faza de volum a adsorbantului si o valenta ocupata de o grupare OH. Aceste grupe pot fi libere sau legate prin punti de hidrogen de moleculele de apa care se adsorb pe suprafata ; grupe silanol vicinale (reactive) cind doi atomi de siliciu vecini contin fiecare cate o grupare OH care sunt suficient de apropiate pentru a forma punti de hidrogen. Gruparile geminale constau din 2 grupe OH atasate la un singur atom de siliciu. Puntile siloxanice provin in urma deshidratarii la 900 K a grupelor silanol vicinale. Puterea relativa a acestor grupe (Fig. ) ca si centre de adsorbtie este : legat < libere < geminale < reactive.

Fig. Tipuri de grupari silanol.

Apa este legata de suprafata silicagelului atat ca si apa "capilara" cat si ca apa asociata gruparilor hidroxil de pe suprafata. Primul tip de apa, fiind fizic adsorbita poate fi indepartata prin incalzire la 105 ⁰C. Cel de-al doilea tip leagata de suprafata de silicagel prin punti de hidrogen poate fi indepartata prin incalzire la 120-180 C. Cu cat procentul de apa adsorbita pe suprafata este mai mic cu atat activitatea este mai mare.

2. Alumina

Alumina este oxidul de aluminiu hidratat Al₂O₃nH₂O, unde n variaza intre 0- Activitate adsorbanta si catalitica prezinta numai g-alumina, care se produce prin descompunerea termica controlata (700-1100⁰C) a gibbsitei si a bhemitei. Are polaritatea asemanatoare silicagelului dar chimia suprafetei este diferita avand o concentratie mica de centri activi de tip acid Brnsted si un numar mare de centri activi tip acid sau baza Lewis. Cu cresterea temperaturii de calcinare centri de tip Brnsted se transforma in centri de tip Lewis. Centri Lewis acid se manifesta prin acceptarea unei perechi de electroni. Continutul total de grupe hidroxil pentru g-alumina este de 3mmol/m². Datorita prezentei oxidului de sodiu, g-alumina are caracter bazic dobandind proprietati schimbatoare de cationi. Alumina bazica, prin neutralizare poate fi transformata in alumina neutra sau chiar acida (Fig.4.). Alumina acida are proprietati schimbatoare de de anioni.

Suprafata specifica a aluminei variaza intre 50-200 m²/g, retinand preferential compusi organici nesaturati si aromatici. Retentia compusilor organici cu caracter acid sau bazic poate fi controlata prin intermediul naturii aluminei (pH).

Fig. 4. Tipuri de alumina.a)- alumina acida ; b)- alumina neutra ; c)- alumina bazica

Alumina sau oxidul de aluminiu este un adsorbant mai puternic decat silicagelul, prezentand un efect catalitic. Componentii cu caracter acid (pH < 5) sunt retinuti ireversibil. Exceptand hidrocarburile alifatice toate substantele organice separate prin cromatografie sunt adsorbite intr-o masura mai mare sau mai mica pe alumina. Pentru separarea substantelor cu caracter acid se poate utiliza alumina acida (a), iar pentru substante cu caracter bazic, alumina bazica (b). Exista si alumina neutra (c).

Straturile subtiri uzuale sunt cele de 0,2-0,3 nm grosime, care dau si o rezolutie optima. Electrolitic s-a reusit sa se obtina straturi de 6 μm pe foi de aluminiu si care confera eficienta si sensibilitate ridicata analizei.

Alte faze stationare

Poliamida are numeroase aplicatii in separarea de substraturi polare cum ar fi flavonele, fenolii, esterii, aminoacizii, nitroderivatii etc.

Kiselgurul este de fapt un pamant diatomitic purificat, tratat termic si adus la granulatia corespunzatoare utilizarii in straturi subtiri (10-40 μ). Kisegurul se utilizeaza ca aditiv pentru marirea vitezei de migrare pentru unii adsorbenti fini (MgO, carbuni etc) ca suport pentru faze stationare lichide, pentru micsorarea activitatii unei alte faze stationare.

Oxidul ce magneziu hidratat si hidroxidul de magneziu se folosesc in separarea computilor naturali, de exemplu: lipide, steroide, carotinoide etc.

Florisitul este un adsorbent acid, intermediar intre alumina si silicagel, avand o tendinta mai redusa de a cataliza unele reactii.

Gelurile se folosesc in cazul excluziunii sterice, hidroxidul de calciu, s-a folosit pentru separarea carotinoidelor, zaharul pudra este un adsorbent bun pentru clorofile si compusi asemanatori, folosit la separarea derivatilor hidroxilici.

4. FAZA MOBILA

Alegerea fazei mobile pentru o separare data constituie etapa cheie in vederea realizarii unei bune separari in cromatografia pe strat subtire. Ca si faza mobila se folosesc o serie de solventi organici sau amestecuri ale acestora

Pentru ca un solvent sa poata fi utilizat ca faza mobila trebuie sa indeplineasca urmatoarele conditii: tarie proprie ε^o, vascozitate scazuta, compatibilitate cu sistemul de detectie, stabilitate si compatibilitate cu adsorbentul, volatilitate pentru a facilita recuperarea componentului, sa fie uzual, usor de purificat si ieftin.

In privinta alegerii celui mai potrivit solvent, de mare utilitate este seria eluotropa. Pentru silicagel exista urmatoarea serie eluotropa, valorile din paranteza reprezentand taria eluentului (ε^o): hexan, eter de petrol(0,00), ciclohexan(0,03), tetraclorura de carbon(0,14), toluen(0,22), benzen(0,25), cloroform(0,31), eter etilic(0,39), acetat de etil(0,45), acetona(0,43), alcool n-propilic(0,63), etanol(0,68), metanol(0,75), apa(mare). Prin combinarea solventilor de mai jos in diferite proportii, se pot obtine amestecuri de solventi de tarie egala.

Selectarea sistemului de solventi se face in functie de natura polaritatii compusilor de separat si al gradului de activitate al adsorbantului

De mare utilitate este clasificarea in opt grupe a solventilor facuta de Snyder (tab.).

Tabelul Solventi utilizati in cromatografia pe strat subtire

Astfel, Snyder clasifica solventii pe baza capacitatilor lor de acceptor de proton (X_e), donor de proton(X_d) si a interactiunii de dipol (X_n) - unde X_e , X_d si X_n reprezinta parametrii de selectivitate calculati pentru etanol, dioxan, respectiv nitrometan - si a caracterizat selectivitatea lor prin intermediul unei diagrame triunghiulare, in care solventii sunt impartiti in opt grupe, pe baza proprietatilor lor fizico-chimice. Solventii din aceeasi grupa prezinta aproximativ interactiuni similare.

Pe de alta parte, exista o scara a polaritatii si in randul diferitelor clase de compusi dupa cum urmeaza: hidrocarburi<esteri<cetone<amine<alcooli<acizi.

In cazul compusilor nepolari se vor alege solventi nepolari si adsorbent cu activitate ridicata. Pentru compusii polari se vor utiliza solventi polari si adsorbenti cu activitate scazuta .

5. APARATURA FOLOSITA IN CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBTIRE

5.1. Dispozitive pentru aplicat probe

Modul de aplicare a probelor depinde de tipul analizei. In cazul analizei calitative probele se aplica sub forma de spot. In cazul analizei cantitative probele se aplica sub forma de benzi scurte sau spoturi cu microcapitare calibrate sau microseringi. Pentru scopuri preparative se recomanda aplicarea probelor sub forma unor benzi lungi pe toata latimea placii. Aplicarea probelor se face cu manual, cu dispozitive semiautomate sau cu aparate automate.

1. Dispozitive manuale de aplicat probe. Cele mai simple dispozitive de aplicat probe sunt microcapilarele care pot fi confectionate in orice laborator si micropipete gradate (1μl, 2l, 5l, 10l si 20l). De asemenea pentru aplicarea probelor sub forma de spot se pot utiliza microseringi.

2. Dispozitivul automat pentru aplicarea spoturilor. Spoturile sunt aplicate automat, de un dispozitiv controlat de un microprocesor. Se poate fixa astfel cantitatea de proba care trebuie aplicata, tipul aplicarii (banda sau spot), distanta de aplicare, atat fata de marginea inferioara cat si distanta dintre spoturi. O facilitate deosebit de importanta pe care o asigura aceste aparate este aplicarea in ciclii a probei. Intre ciclii solventul este evaporat cu ajutorul unui curent de aer.

5.2. Tehnici de developare

Developarea este operatia prin care componentii probei se separa unii de altii, datorita interactiunilor diferite pe care acestia le realizeaza atunci cand sunt purtati de-a lungul fazei stationare de catre faza mobila. In urma acestei operatii se obtine cromatograma, care in cazul cromatografiei pe strat subtire este o succesiune de spoturi . Cromatografia pe strat subtire conventionala implica o singura developare intr-un sistem de solventi adecvat. Aceasta se realizeaza prin introducerea placii in eluent, care este apoi lasat sa migreze suficient de departe pe placa pentru a obtine separarea dorita. Aceasta procedura simpla este adesea insuficienta cand este necesara separarea amestecurilor complexe si in special cand componentii acopera un domeniu larg de polaritati. Pentru solutionarea acestor probleme s-au pus la punct mai multe tehnici: developarea liniara sau circulara. Developarea liniara se poate realiza in mai multe variante: continua; multipla, bidimensionala. Developarea se poate realiza la presiune normala sau sub presiune (OPTLC). De asemenea poate implica operarea manuala sau automatizata [55].

a) Developare simpla

Pentru developarea continua solventul este lasat sa avanseze pe o distanta fixata pe placa, moment in care este evaporat continuu. Tehnica exploateaza faptul ca in cromatografia pe strat subtire viteza de migrare a fazei mobile este invers proportionala cu patratul distantei strabatute. Realizarea unei distante de developare scurte unde viteza solventului este mai mare, permite ca separarea sa fie rapid obtinuta, in special cand este utilizata in crogmatografia pe strat subtire de inalta performanta (HPTLC).

b) Developare multipla

In developarea multipla, placile sunt repetat redevelopate in acelasi sistem de solventi sau in sisteme diferite. Daca placa este redevelopata cu acelasi sistem de solventi, se obtine doar cresterea valorilor R_f , iar daca placa este redevelopata cu sisteme diferite de solventi, se va obtine o imbunatatire a separarii. Intre developari, placa este scoasa din cuva de developare si solventul indepartat prin uscare.

c) Developarea multipla programata

Developarea multipla se realizeaza cu aparate automate de developat. Placa este developata cu solventi diferiti ca si compozitie pe distante de migrare crescatoare. Intre developari, placa este uscata.

d) Developarea bidimensionala

Pe placa, pe linia de start, se aplica un spot si se developeaza cu eluentul dat, apoi placa se usuca, se intoarce cu 90⁰, noua linie de start fiind linia de separare a primului spot. Daca developarea se realizeaza cu acelasi eluent atunci spoturile compusilor separati vor fi plasati pe diagonala placii. Rezultate mai bune se obtin in cazul in care se utilizeaza sisteme diferite de developare, cel de-al doilea fiind mai polar.

e) Developare circulara si anticirculara

In developarea circulara solventul este alimentat in centrul placii si migreaza catre exteriorul acesteia. Proba de analizat este dispusa intr-un cerc de jur imprejurul locului de intrare al solventului. Dupa developare compusii separati se vor dispune in cercuri concentrice. Intre valoarea R_f din developarea liniara si cea circulara exista relatia:

In developarea anticirculara migrarea solventului se face de la marginile placii catre interiorul acestora, spre centru. Proba este aplicata intr-un cerc de raza mai mica decat aceea a liniei de alimentare a solventului.

f) Developarea sub presiune (OPTLC)

In multe separari pe strat subtire, placa este expusa vaporilor solventului in care este developata cu consecinte considerabile pentru cromatografie. Acest inconvenient este inlaturat in developarea sub presiune. Stratul subtire este acoperit cu ajutorul unei presiuni externe, astfel este eliminat spatiul vaporilor de deasupra placii.

5. Camerele cromatografice pentru developari pe strat subtire

In analiza cromatografica pe strat subtire se disting doua tipuri principale de camere cromatografice: camerele normale (N) si camerele sandwich (S).

a)      Camera cromatografica normala (N) pentru developarea ascendenta. Cele mai uzuale camere sunt cele propuse de Stahl, avand forma paralelipipedica, inchise cu un capac slefuit pe margini. Camerele pot avea diferite dimensiuni functie de dimensiunile placii cromatografice: (pentru placi de 2020 cm si 2010 cm). De regula camerele cromatografice sunt construite din sticla, material inert pentru toti solventii utilizati in cromaotgrafia de lichide. Cu aceeasi eficienta pot fi utilizate vase din sticla cilindrice, de dimensiuni adecvate placilor utilizate. Placa cromatografica este rezemata de peretii vasului (fig.5.a).

a      b

Figura 5. Camera de developare normala N (a) si S (b) : 1) placa de strat subtire, 2) placa de sticla, 3) clema, 4) invelis dublu de otel inoxidabil, 5) solvent, 6) suport.

b)      Camera Sandwich (S). O astfel de camera se compune din doua placi suprapuse (fig.5.b):

o placa cromatografica obisniuta, care pe trei margini are faza stationara razuita

o contra-placa de sticla, care pe trei laturi are lipita o rama de sticla.

Prin suprapunerea celor doua placi se formeaza o camera de developare cu dimensiuni foarte mici, a carui pereti sunt formati din placa cu strat subtitre si contraplaca. Cele doua placi sunt mentinute in contact cu ajutorul a doua cleme fixatoare. Intrge anasamblul este introdus intr-o cuva avand capacul perforat, astfel incat placile sa ajunga in solvent. Clemele de fixare au si rol de sprijin.

Caracteristica principala care diferentiaza camerele cromatografice este volumul lor, respectiv distanta dintre stratul subtire si peretele camerei. Astfel, camerele de tip N au un volum mare, respectiv o distanta strat-perete mai mica de 3 mm, comparativ cu camerele S care au un volum mic, respectiv o distanta mai mica de 3 mm.

5.4. Vizualizarea

Vizualizarea este etapa din analiza cromatografica prin care sunt puse in evidenta spoturile compusilor separati [56, 57.].

In cazul in care componentii sunt colorati, respectiv absorb radiatia din domeniul vizibil al spectrului electromagnetic, nu este necesara o tehnica speciala de vizualizare, utilizanduse o placa normala si inspectarea se realizeaza in lumina alba.

Pentru compusii care nu prezinta absorbanta in domeniul vizibil se pot utiliza placi fluorescente, care au inglobat in stratul subtire un luminofor. O astfel de placa privita UV (254 mm) se prezinta ca un " camp " fluroscent (galben verzui, roz sau albastru deschis) iar spoturile componentului apar ca pete de culoare inchisa nefluroscente - metoda de vizualizare fiind cunoscuta sub numele de stingerea fluroscentei. In multe cazuri vizualizarea se realizeaza prin pulverizarea pe suprafata placii a unui reactiv de culoare, specific componentului de interes.

Daca compusul analizat prezinta fluorescenta atunci se folosesc placi normale, inspectarea realizandu-se in lumina UV, la 254nm respectiv 366nm.

5.5. Fotodensitometrarea

Cromatograma obtinuta in urma develorparii poate furniza informatii de natura calitativa si in unele cazuri, prin compararea marimii spoturilor sau a intensitatii coloratiei, informatii semicantitative. In vederea efectuarii analizei cantitative este necesara ridicarea fotodensitogramei, respectiv transformarea spoturilor in picuri cromatografice.

Procesul se bazeaza pe absorbtia radiatiei electromagnetice de o anumita lungime de unda de catre componenti, intr-un rapot proportional cu concentratia componentului in spot. Astfel, o parte din intensitatea radiatiei incidente este absorbita iar cealalta reflectata sau transmisa, deci absorbanta poate fi masurata in cele doua moduri (fig.6.a, b):

reflexie

transmitanta.

Ca linie de baza se considera absorbanta fondului placii. Bazei picului cromatografic ii corespund zonele marginale ale spotului unde concentratia componentului este mica iar varful picului cromatografic corespunde centrului spotului (fig.6.c.).

Figura 6. Principiul fotodensitometrarii. a) reflexie ; b) transmisie ; c) obtinerea picului cromatografic

La ora actuala exista in comert fotodensitometre total computerizate echipate cu softuri speciale de prelucrare a fotodensitogramelor obtinute.

6. ANALIZA CALITATIVA

In cazul in care compusii sunt colorati sau in urma pulverizarii rezulta compusi colorati, identificarea se poate face si pe baza culorii colerata cu valoarea R_f-ului. Identificarea se poate realiza si pe baza spectrului de absortie in UV-VIS in situ, direct de pe placa. Dupa separare "spotul poate fi decupat" si componentul poate fi transferat in solutie, identificarea relizandu-se prin alte metode: spectru UV, IR, MS etc [58].

7. ANALIZA CANTITATIVA

In cazul cromatografiei pe strat subtire determinarile cantitative se pot realiza atat direct pe placa prin fotodensitometrare in UV-Viz - determinare in situ, cat si prin elutia prin diverse metode a compusului de pe placa urmata de determinarea cantitativa printr-o metoda instrumentala potrivita - tehnici de transfer. Cea mai uitlizata metoda este cea de determinare in situ, deoarece sunt evitate pierderile de substanta care pot avea loc in timpul transferului.

Fotodensitograma obtinuta este prelucrata in acelasi mod ca si cromatogramele din cromatografia de lichide.

In cazul cromatografiei pe strat subtire pentru determinarea cantitativa se prefera utilizarea curbei de calibrare. Aria picurilor de interes se determina automat prin programul cu care este echipat fotodensitometrul. Analiza cantitativa decurge in doua etape:

- obtinerea ecuatiei curbei de calibrare A= f (m) unde A= aria picului cromatografic corespunzator unei cantitati de compus data -m.

- pe baza ariei picului cromatografic corespunzator compusului din proba necunoscuta si pe baza ecuatiei de regresie se determina cantitatea de compus din spot.

8. ANALIZA COLORANTILOR ALIMENTARI SINTETICI

Alaturi de metodele spectrofotometrice, colorantii alimentari sintetici pot fi analizati si prin metode cromatografice, cum ar fi cromatografia de lichide de inalta performanta cu formare de perechi de ioni, cromatografia de schimb ionic si electroforeza. Cromatografia pe strat subtire ocupa un loc important in identificarea si dozarea colorantilor alimentari sintetici, in literatura de specialitate existand o serie de articole care trateaza pe larg aceasta tema [42, 59]

Cele mai utilizate faze stationare sunt cele de silicagel [32]. Sistemele de developare variaza foarte mult, putandu-se folosi atat amestecuri de natura anorganica cat si organica, cum ar fi:

amoniac (d = 0,88) - apa (1:99, v/v),

clorura de sodiu solutie apoasa 2,5 %;

clorura de sodiu 2 % in alcool etilic 50 %

apa - acid clorhidric (d = 1,18) (30:6,5, v/v)

se dilueaza 5 ml amoniac 0,88 la 100 ml cu apa si apoi se dizolva 2 g citrat trisodic ;

izobutanol - etanol - apa (3:2:1, v/v) ;

n-butanol - apa - acid acetic glacial (20:12:5, v/v)

izobutanol - etanol - apa (3:2:2, v/v) ; apoi la 99 ml amestec se adauga 1 ml amoniac (d = 0,88) ;

etil-metil-cetona - acetona - apa - amoniac (d = 0,88), (350:150:150:1, v/v)

etil-metil-cetona - acetona - apa (7:3:3, v/v) ;

acetat de etil - piridina - apa (11:5:4, v/v).

Confirmarea identitatii colorantilor separati se realizeaza prin comparatia valorilor R_f (tab. 4.) si a spectrelor in vizibil ridicate in-situ.

In literatura de specialitate, ca faze mobile utilizate in vederea separarii colorantilor alimentari sintetici, sunt mentionate o gama larga de sisteme: acetate de etil-metanol-amoniac 25% (33:10:10, v/v) [60], etanol-dietilamina-CHCl₃-amoniac 12,5% (6:6:5:3 v/v), [61], etanol - n-butanol - apa (9:2:1, v/v ) [ 62 , n-butanol-acid acetic glacial-etanol-apa (10:2:0.5:5) [ 63]

In vederea obtinerii unei separari superioare s-au folosit de asemenea si placi de inalta performanta, utilizandu-se ca faze mobile fie sistemul n-propanol - amoniac33% - metanol (150:37:30, v/v) fie acetat de etil - n-propanol - apa (10:60:30, v/v)

Separarea colorantilor alimentari sintetici s-a realizat si prin alte mecanisme decat cele de simpla repartitie. Astfel placile de silicagel au fost impregnate cu bromura de cetiltrimetilamoniu (CTMA) iar ca faza mobila s-a utilizat sistemul metanol-acetona (9:1) + acid acetic glacial 1%

O alta posibilitate de separare se bazeaza pe interactia colorantului anionic cu un ion metalic, impregnat anterior pe placa cromatografica de silicagel. Astfel Srivastava si colab. utilizeaza o solutie de acetate de cadmiu 5% pentru impregnare si doua sisteme de faza mobila : butanol-benzen-acetat de etil (40:35:25, v/v) sau n-butanol-apa-acid formic (35:10:5, v/v) [66]. Intr-o alta varianta, acelasi autor, utilizeaza pentru impregnare un amestec de molibdat de amoniu si sulfat de cupru, developarea realizandu-se cu sitemul butanol-amoniac 50%-dioxan (25:5:10, v/v) [67]

In ultima perioada, ca alternativa a analizei cantitative prin fotodensitometrare, a fost folosita videodensitometrarea, cromatogramele obtinute pot fi captate electronic si apoi interpretate cu ajutorul unor softuri special proiectate. De asemenea utilizand tehnici moderne de interpretare a spectrelor in vizibil a putut fi realizata analiza calitativa si cantitativa a colorantilor incomplet separati prin cromatografie pe strat subtire [68, 69].

O alta faza stationara utilizata la separarea colorantilor prezentata in literatura de specialitate, este celuloza. Ca faze mobile a fost utilizat sistemul etanol-butanol-piridina-apa (1:7:6:6) [70] sau acetate de etil-butanol-piridina apa (5:5:6:5) [71].

Placile de alumina au fost developate cu sistemul de faza mobila metanol - amoniac (8:2, v/v) [72].

Au fost utilizate de asemenea si placi de poliacrilonitril utilizandu-se mai multe sisteme de developare: dietilamina - acid acetic glacial - apa (20:5:75, v/v) [73], piridina - acid acetic glacial - apa (20:5:75, v/v), etanol - acetat de zinc - apa (20:1,8:80) si dietil amina - acid acetic glacial - etanol apa (20:5:20;55, v/v)

O alta faza stationara este poliamida, faza mobila utilizata fiind un amestec de metanol-etanol-alcool izoamilic- amoniac 25% (15:10:5:3, v/v) [74].

Separarea colorantilor alimentari sintetici a fost realizata de asemenea si prin cromatografie pe strat subtie pe faza inversa RP-18. Ca faze mobile au fost utilizate sistemele:

solutie apoasa Na₂SO₄ 5%-metanol-acetonitril (10:3:3, v/v) sau Na₂SO₄ 5%-metanol-etil metil cetona (1:1:1, v/v). [75-77],

metanol-apa (17:3) [78],

O alta modalitate de separare a colorantilor alimentari sintetici se bazeaza pe impregnarea prealabila a placii de Sil -C18 cu o solutie metanolica de bromura de tetrabutilamoniu, urmata de separarea analitilor cu o solutie apoasa de metanol 80% ca faza mobila [79].