NOTIUNI GENERALE DE CROMATOGRAFIE

NOTIUNI GENERALE DE CROMATOGRAFIE

Cromatografia este o metoda fizico-chimica utilizata pentru separarea unor substante dintr-un amestec, are la baza migrarea substantelor intre faza stationara si cea mobila datorata diferentei de absortie, solubilitatea, marimea moleculelor, etc.

Dupa natura fazei stationare metodele de cromatografie sunt:

cromatografia pe hartie (CH)

cromatografia pe strat subtire (CSS)

cromatografia pe coloana (CC)

In functie de natura fazei mobile cromatografia se imparte in:

cromatografie de lichide de inalta performanta (HPLC)

cromatografie de faza gazoasa

Analiza cromatografica a produselor vegetale evidentiaza urmatoarele:

identitatea produselor vegetale

izoleaza si caracterizeaza principiile active

controleaza calitatea produselor.

Tehnica de lucru in cazul cromatografiei pe hartie (CH) si cromatografiei pe strat subtire (CSS) presupune urmatoarele etape:

obtinerea solutiei de analizat

obtinerea solutiei martor

alegerea fazei stationare

aplicarea solutiei de cromatografie pe faza stationara

alegerea fazei mobile

developarea si uscarea cromatogramei

revelarea cromatogramei

examinare

Cromatografia pe hartie (CH)

CH este o metoda de repartitie datorita factorilor fizico-chimici care stau la baza separarii cromatografice.

Faza stationara - hartie cromatografica de grosimea si porozitatea adecvata (tip Whatman), taiata in benzi (dimensiuni 8-10 cm/40 cm)

Faza mobila (developantul) - este formata dintr-un solvent sau amestecuri de solventi.

Alegerea solventului este in functie de natura principiilor active ce urmeaza sa

se analizeze.

Faza mobila se introduce in cuva (vasul cromatografic) cu 24h inaintea executarii experientei pentru saturarea atmosferei cu vaporii sistemului de solventi. Vasele pot fi cilindrice sau paralelipipedice.

Solutia de analizat (proba sau etalon) - se aplica cu micropipete sau capilare de sticla pe linia de start la 5 cm de margine benzii de hartie (ascendant) prin picurarea a 2-5 μl, diametrul petei fiind de cel mult 0,6 cm, distanta dintre pete de 3-4 cm, iar de marginea laterala de 2,5 cm.

Hartia se introduce in cuva si se asteapta ca faza mobila sa ajunga la distanta propusa (linia de front) dupa care se scoate din vas si se usuca. Se noteaza timpul de migrare si distanta de migrare.

Spoturile se evidentiaza in vizibil sau in UV la λ = 254 nm, λ = 360 nm dupa revelare cu reactivul adecvat.

Caracterizarea spoturilor se face pe baza lui R_f dupa urmatoarea formula:

R_f = a/b

a - distanta parcursa de substanta de la punctual de aplicare al solutiei pana in centrul petei (in cm)

b - distanta parcursa de developant de la linia de start pana la linia de front (in cm)

Se comapara pe cromatograma valoarea R_f si culoarea petelor obtinute penru solutia proba si cea etalon, cele doua pete trebuie sa aiba caracteristici identice.

Cromatografia pe strat subtire (CSS)

CSS difera de CH prin faptul ca faza stationara este formata dintr-o pulbere absorbanta de puritate cromatografica. CSS reprezinta metoda de separare, identificare si determinare cantitativa a substantelor chimice dintr-un amestec.

Faza stationara - pulberi cu granulatie fina.

Ex: silicagel, kieselgur, silicat de magneziu, poliamida, oxidul de aluminiu, celuloza.

Faza mobila - este formata dintr-un solvent sau amestecuri de solventi.

Ex: etanol, metanol, acetona, cloroform, benzen, eter etilic, eter de petrol, acetate de etil, n-propanol.

Separarea se bazeaza pe distributia diferita a substantelor intre cele doua faze, stationara si mobila, substantele antrenate de faza mobila sunt trecute prin faza stationara. Cu cat o substanta este absorbita de faza stationara, cu atat viteza de migrare este mai mare, deci si R_f-ul spotului este mai mare si invers.

Pregatirea placilor:

- pulberea se suspenda in apa (1g/ 2ml) se agita si se aplica pe placa, fie manual, fie cu ajutorul unui dispozitiv special intr-un strat uniform de aproximativ 0,25 ml grosime. Placile se usuca la temperatura ambienta 30 minute, apoi se introduc in etuva 45-60 minute la 110C, dupa care se racesc in exicator cu clorura de calciu anhidra. Placile pregatite se pastreaza in exicator si trebuiesc folosite in maxim 3 zile, daca nu fiind necesara o reactivare in etuva.

Aplicarea solutiei de analizat se face ca in cazul CH.

Diferenta dintre CH si CSS consta in faptul ca, faza mobila se introduce in etuva cu cel putin 30 minute inaintea placii, peretii etuvei se captusesc cu hartie imbibata in developant.

Evidentierea spoturilor se face exact ca in cazul CH.

Cromatografia pe coloana CC

Faza stationara este formata dintr-un material absorbant de granulatie corespunzatoare (silicagel, celuloza, oxid de aluminiu) care se introduce intr-un tub de sticla prevazut in partea inferioara cu un robinet (coloana cromatografica).

Peste faza stationara se adauga solutia extractului vegetal, lasand sa curga pana la parcurgerea in totalitate a coloanei, se adauga solventul pur pentru separarea substantelor componente in zone de absorbtie diferite. Fiecare fractiune se colecteaza in vase separate, se evapora si se identifica substantele separate (CSS, UV, IR, etc.).

Cromatografia in faza gazoasa GC

Reprezinta o metoda fizico-chimica de separare a compusilor volatili din amestec.

Faza mobila - gaz .

Faza stationara este un solid sau un lichid repartizat uniform pe peretii coloanei capilare.

Produsele analizate se aduc in stare de vapori fara a produce degradarea termica a probelor.

Faza mobila se deplaseaza continu prin coloana, iar la iesire gazul purtator trece prin detector care emite un semnal proportional cu concentratia componentei din aceasta faza. Detectorul este conectat la sistemul de inregistrare (gaz cromatograf), astefel picaturile coresunzatoare fiecarui compus separate se caracterizeaza printr-un timp de detentie ( timpul dintre injectare pana la iesirea din coloana). Acest aparat poate fi cuplat la un spectometru de masa inregistrandu-se in acest fel spectrele de masa ale substantelor separate, care se identifica ulterior cu ajutorul standardelor.

Cromatografi de lichide de inalta performanta ( HPLC )

HPLC se bazeaza pe separarea substantelor dintr-un amestec in care faza mobila este un lichid, iar faza stationara formata dintr-un solid de granulatie fina, impregnat cu un lichid sau un solid pe care sunt grefate grupari organice , faza care se afla intr-o coloana.

Faza mobile cicula cu un debit constant prin coloana cromatografica, trecand apoi in detector.

Compozitia fazei mobile poate ramane constanta (elutie izocratica) sau sa varieze dupa un anumit program (gradient de elutie).

Sistemul de detectare se bazeaza pe spectrofotometrie de absorbtie, refractometrie diferentiala si permite determinarea cantitatilor de componente prezente.

Se inregistreaza astfel o cromatograma formata din picaturile coresunzatoare componentelor separate caracterizate printr-un anumit timp de detentie.

Masurarea ariilor de sub picaturi ne indica proportia componentelor din amestec.