Metoda de detectare de referinta : Regulamentul CE 2075/2005, Metoda digestiei esantioanelor combinate utilizand un agitator magnetic - TRICHINELOZA

Metoda de detectare de referinta : Regulamentul CE 2075/2005, Metoda digestiei esantioanelor combinate utilizand un agitator magnetic - TRICHINELOZA

Metoda actuala

Aparatura si reactivi:

Un cutit sau foarfeci si pense pentru prelevarea esantioanelor.

Tavi impartite in 50 de patrate care sa poata contine fiecare esantioane de carne aproximativ de 2 grame sau alte ustensile cu garantii echivalente privind transabilitatea esantioanelor.

Un mixer dotat cu o lama ascutita de tocat. Atunci cand esantioanele cantaresc mai mult de 3 grame se utilizeaza un tocator de carne prevazut cu orificii de 2 - 4 mm sau foarfeci. In cazul carnii congelate sau al limbii (dupa indepartarea srtatului superficial care nu se poate digera), este necesara utilizarea unui tocator de carne si marirea considerabila a marimii esantionului.

Agitator magnetic dotati cu o placa pentru incalzire cu temperature controlata si cu bare magnetice acoperite cu Teflon cu o lungime de aproximativ 5 cm.

Tuburi pentru decantare conice din sticla cu o capacitate de cel putin 2 litri prevazute de preferinta cu robineti de siguranta din Teflon.

Suporti cu inele si dispositive de fixare.

Site cu finetea ochiului de 180 microni cu un diametru de 11 cm prevazute cu o plasa din otel inoxidabil.

Palnii cu un diametru interior de cel putin 12 cm, destinate sitelor.

Pahare de laborator din sticla cu o capacitate de 3 litrii.

Eprubete din sticla gradate cu o capacitate de 50 - 100 ml sau tuburi de centrifugare.

Un trichineloscop prevazut cu o placa orizontala sau un stereo-microscop cu lumina transmisa diascopic cu intensitate reglabila.

Mai multe placi Petri (se utilizeaza cu un stereo-microscop) cu un diametru de 9 cm, al caror fund a fost impartit in patrate 10x10 mm cu ajutorul unui instrument ascutit.

Un bazin pentru numararea larvelor (se utilizeaza un trichineloscop) format din placi acrilice cu o grosime de 3 mm si prezentand urmatoarele caracteristici:

-fundul bazinului: 180x40 mm impartit in patrate.

-placi laterale 230x20 mm

-placi frontale 40x20 mm. Fundul si placile frontale trebuie fixate intre placile laterale astfel incat sa formeze 2 mici manere pe cele 2 extremitati. Partea superioara a fundului trebuie sa se ridice la 7 - 9 mm fata de baza cadrului format de placile laterale si frontale. Elementele trebuie lipite cu un lipici adaptat materialului.

- O fole de aluminiu.

- Acid clorhidric de 25%

- Pepsina concentratie 1:10000 NF (US. National Formulary) corespunzand la 1:12500 BP (British Pharmacopheea), corespunzand la 2000 FIP (Federation Internationale de Pharmacie).

- Apa de la robinet incalzita la +46, +48 grade Celsius.

- Un cantar cu o precizie de cel putin 0.1 grame.

- Tavi metalice cu o capacitate de 10-15 litri pentru recoltarea sucurilor digestive ramase.

- Pipete de diferite marimi (1, 10 si 25ml) si suporti pentru pipete.

- Un termometru cu o precizie de 0.5 grade Celsius cu o scara de la +1 la 100 grade Celsius.

- Un sifon pentru apa de la robinet.

Prelevarea de esantioane si cantitatea care urmeaza sa fie digerata:

Atunci cand carcasele de porci domestici sunt intregi se preleveaza un esantion de cel putin un gram de pe unul din pilierii diafragmatici in zona de tranzitie intre partea muscular si partea tendinoasa. Se pot utilize o pensa speciala pentru o precizie cuprinsa intre 1.00 si 1.15 grame. Pentru scroafele si vierii reproducatori, se preleveaza un esantion mai mare de cel putin 2 grame de pe unul din pilierii diafragmatici in zona de tranzitie intre partea musculara si partea tendinoasa in cazul in care nu exista pilieri diafragmatici se preleveaza dublul cantitatii respective 2 grame (4 grame pentru scroafe si vierii reproducatori) de pe partea diafragmei situate langa coaste sau stern in muschii masticatori, in limba sau in musculature abdominala.

In cazul bucatilor de carne, se preleva un esantion cantarind cel putin 5 grame din muschii striati cu un continut redus de grasime sip e cat posibil din apropierea oaselor sau a tendoanelor. Se preleva un esantion de aceeasi marime din carne care nu este destinata unei preparari in profunzime sau unui alt tratament dupa sacrificare.

In cazul esantioanelor congelate se preleva un esantion cantarind cel putin 5 grame din muschii striati in vederea analizei.

Greutatea esantioanelor de carne se raporteaza la un esantion de carne fara grasime si fara aponevroza. Va fi necesar sa se aiba in vedere in mod deosebit, in cursul prelevarii de esantioane din muschii limbii evitarea oricarei cantaminari cu partea superficiala a limbii care este indigesta si impiedica lectura sedimentului.

Procedura

Esantioane combinate complete (100 grame de esantioane in acelasi timp)

Se introduc 16 +- 0.5 ml de acid clorhidric intr-un pahar de laborator de 3 litri continand 2 litri de apa de la robinet incalzita la +46, +48 grade Celsius, se plaseaza o bara magnetica in paharul de laborator, se pune paharul pe placa preincalzita si se demareaza agitarea.

Se adauga 10 +- 0.2 grame de pepsina.

Se toaca in mixer 100 grame din esantioanele prelevate in comformitate cu punctual 2

Se transfera carnea toccata in paharul de 3 litrii continand apa, pepsin si acid clorhidric.

Se inmoaie de mai multe ori dispozitivul de tocare al mixerului in lichidul de digestive care se afla in paharul de laborator si se clateste bolul mixerului in lichidul de digestive pentru a scoate carnea care este aderenta.

Se acopera paharul de laborator cu o folie de aluminiu.

Agitatorul magnetic trebuie reglat astfel incat sa se poata mentine o temperatura constanta de +44, +46 grade Celsius pe durata functionarii. In timpul agitarii lichidului de digestie trebuie sa se invarta cu o viteza sufficient de ridicata pentru a forma un vartej central profund, fara sa provoace stropi.

Se agita lichidul de digestie pana cand particulele de carne dispar (aproximativ 30 minute). In continuare se opreste aparatul, se filtreaza lichidul de digestie printr-o sita si se pune filtratul intr-un tub de decantare. Pot fi necesare perioade de digestie mai lungi (care nu depasesc 60 de minute) pentru tratarea anumitor tipuri de carne (limba, vanat).

Procedeul de digestie se considera satisfacator in cazul in care maximum 5% din greutatea esantionului initial ramane pe sita.

Se lasa lichidul de digestie in tubul de decantare timp de 30 de minute.

Dupa 30 de minute, se transfera rapid un esantion de 40 ml din lichidul de digestive in eprubeta gradate sau in tubul de centrifugare.

Se pastreaza lichidele de digestie si celelalte lichide reziduale pe o tava pana la incheierea citirii rezultatelor.

Se lasa sa se odihneasca esantionul de 40 ml timp de 10 minute. Se aspira apoi cu grija 30 ml de lichid plutitor, astfel incat sa se inlature straturile superioare si sa se lase un volum maxim de 10 ml.

Se varsa esantionul de 10 ml de sediment ramas intr-un bazin pentru numararea larvelor sau intr-o placa Petri.

Se clateste eprubeta gradate sau tubul de centrifugare cu maximum 10 ml de apa de la robinet care se adauga esantionului in bazinul sau in placa Petri pentru numararea larvelor. Se recurge apoi la examenul trichineloscopic al esantionului marit de 10 - 15 ori. Este autorizata vizualizarea cu ajutorul altor tehnici cu conditia ca examinarea de esantioane martori pozitivi sa dovedeasca ca aceste tehnici dau un rezultat la fel de bun ca si metodele de vizualizare traditionale. In toate cazurile in care exista zone suspecte sau forma asemanatoare parazitilor se utilizeaza o marire mai semnificativa (de 60 - 100 de ori).

Lichidele de digestie trebuie examinate de indata ce sunt pregatite. In niciun caz examinarea nu trebuie amanata pentru a doua zi.

In cazul in care lichidele de digestive nu sunt examinate in termen de 30 de minute de la prepararea lor, acestea trebuie limpezite dupa cum urmeaza. Se varsa esantionul final de aproximativ 40 ml intr-o eprubeta gradata si se lasa sa se sedimenteze timp de 10 minute. Apoi se iau 30 ml din lichid de la suprafata pentru a obtine un volum de 10 ml. Se mareste acest volum la 40 ml cu ajutorul apei de la robinet. Dupa o noua perioada de repaus de 10 minute se iau 30 ml din lichid de la suprafata, prin aspirare pentru a obtine un volum maxim de 10 ml, care urmeaza sa fie examinat intr-o placa Petri sau intr-un bazin pentru numararea larvelor. Se spala eprubeta gradata cu maximum 10 ml de apa de la robinet si se adauga lichidul obtinut la esantionul din placa Petri sau din bazinul pentru numararea larvelor in vederea examinarii.

In cazul in care examinarea dovedeste ca sedimentul nu este sufficient de limpede, esantionul va trebui varsat intr-o eprubeta gradate, iar volumul trebuie adus la 40 ml cu ajutorul apei de la robinet. In continuare se vor repeta inca o data etapele descriese anterior. Procedura se poate repeta de 2 - 4 ori pan ace lichidul este suficient de limpede pentru a permite citirea fiabila.

Esantioane combinate mai mici de 100 grame

Dupa caz, se poate adauga un numar maxim de 15 grame la un esantion combinat complet de 100 grame examinat in acelasi timp cu aceste esantioane in conformitate cu punctual 3.1. In cazul in care se adauga mai mult de 15 grame de esantioane, trebuie realizata o noua digestie. In cazul grupelor cantarind pana la 50 grame lichidele de digestie si ingredientele pot ajunge pana la un litru de apa, 8 ml de acid clorhidric si 5 grame de pepsina.

Rezultate positive sau incerte

Atunci cand examinarea unui esantion colectiv are un rezultat pozitiv sau incert, se preleva un nou esantion de 20 grame pe fiecare porc, in conformitate cu punctual 2 litera (a).

Esantioanele de 20 grame provenite de la 5 porci sunt adunate si examinate conform metodei descries anterior. In acest mod vor fi examinate esantioane de 20 de grupe a cate 5 porci. In cazul in care trichinella este detectata intr-o grupa de esantioane de 5 porci, se preleva noi esantioane de 20 grame pe fiecare animal care apartine acestei grupe si fiecare din acestea sunt examinate separat conform metodei descrise anterior.

Esantioanele care contin paraziti sunt pastrate in alcool etilic de 90% in vederea conservarii lor si identificarii speciilor in laboratorul comunitar sau national de referinta.

La sfarsitul prelevarii parazitilor lichidele positive (lichide de digestie, de suprafata, lichide de limpezire) trebuie decontaminate prin incalzire la cel putin 60 grade Celsius.

 

Cantarirea pepsinei pe balanta electronica Cantarirea probei de examinat

pentru digestie artificiala pentru digestia artificiala

 

Maruntirea probei de examinat Agitator magnetic dotat cu placa de incalzire

la 46 - 48 grade celsius

 

Realizarea digestiei artificiale intr-un pahar de laborator de 3 litri acoperit cu folie de aluminiu plasat pe un agitator magnetic reglat la temperatura constanta de 44 - 46 grade celsius si se agita aproximativ 30 minute

 

Se lasa lichidul de digestie in tubul de decantare timp de 30 minute dupa care se transfera intr-un esantion de 40 ml din lichidul de digestie intr-o eprubeta gradata

 

Numararea larvelor de Trichinella spiralis in placuta Petri la  trichineloscop in urma digestiei artificiale

 

Infestatie masiva cu larve de Trichinella spiralis

Infestatie masiva cu larve de Trichinella spiralis

Amintim alte metode

A)  Metoda digestiei esantioanelor combinate cu asistenta mecanica/tehnica a sedimentarii

B)  Metoda digestiei de esantioane colective cu asistenta mecanica/tehnica de izolare prin filtrare

C)  Metoda de digestive automata pentru esantioane collective pana la 35 grame.