Metode de determinare a micotoxinelor

Metode de determinare a micotoxinelor

Pregatirea preliminara a probelor

Micotoxinele prezinta un real pericol atat pentru animale cat si pentru om, si este obligatoriu ca manipularea probelor sa se faca cu grija si sa se lucreze in conditii care sa impiedice contaminarea materialelor si a atmosferei.

In plus, anumite mucegaiuri care produc aceste substante sunt ele insusi toxice: este exemplul lui Aspergillus flavus si Aspergillus parasiticus pentru care s-au diagnosticat trei tipuri de simptome la om: infectie, alergie si toxicoza. Infectia reprezinta o invazie a tesuturilor vii in timp ce alergia este o manifestare de hipersensibilitate la o antigena fungica. Toxicozele sunt maladii rezultate in urma expunerii, in general prin ingerare, prin inhalare sau prin contact direct, la micotoxine produse de mucegaiuri. Trebuie sa se insiste asupra faptului ca atmosfera este un bun vector de contaminare cu micotoxine. Securitatea trebuie sa fie maxima.

Personalul din laborator trebuie sa fie familiarizat cu reglementarile privind securitatea. Mai mult, un control medical al pesonalului este recomandat si trebuie sa se realizeze un set complet de analize la sange. Gestionarea riscurilor de laborator trebuie sa cuprinda trei puncte:

1. identificarea sursei periculoase si a efectelor posibile asupra sanatatii in cazul
nefolosirii echipamentului adecvat;.

punerea la punct a metodelor de manipulare a toxinelor si microorganismelor;

3. intelegerea sensului responsabilitatii pentru a permite aplicarea masurilor de
securitate

Manipularea mucegaiurilor

Culturile trebuie sa fie pastrate in eprubete, placi Petri. Pentru manipularea esantioanelor se recomanda sa se lucreze in cabine securizate biologic. Pentru protectie, personalul trebuie sa poarte in permanenta sort, manusi si masca.

Manipularea produselor mucegaite

Produsele mucegaite nu trebuie sa fie manipulate niciodata fara manusi si analizele se vor face in asa fel incat sa se evite pe cat posibil inhalarea particulelor toxice.

Analiza esantioanelor test

Securitatea manipularii este foarte importanta in timpul acestei operatii. Este primordiala minimizarea contaminarii atmosferice cu vapori toxici si particule de praf. Contactul direct cu toxinele pure sau in solutie trebuie sa fie evitat prin folosirea echipamentului de pipetare mecanic. Toate suprafetele de lucru ca si echipamentele folosite in timpul extractiei trebuie sa fie obligatoriu decontaminate dupa utilizare.

Hranirea animalelor cu alimente contaminate

Cand animalele de laborator sunt hranite cu alimente care contin toxine trebuie sa se poarte in orice moment echipamentul de protectie. Alimentele trebuie sa fie corect etichetate si depozitate cu grija pentru a evita confuziile.

Decontaminarea laboratorului

Sticlaria de laborator si suprafetele care au intrat in contact cu toxinele sunt spalate cu NaClO 0,5%. Carcasele in care au fost tinute animalele de laborator sunt incinerate.

Esantionarea

Studii au aratat ca peste 90% din erorile de cuantificare a micotoxinelor se datoreaza esantionarii necorespunzatoare; trebuie deci sa ne asiguram ca esantioanele prelevate pentru a fi analizate sunt reprezentative.

Este important deci sa se prezinte un plan de esantionare care sa faca parte din reglementarile privind controlul contaminarii cu micotoxine. In ultimii ani, o atentie deosebita a fost acordata ameliorarii si asigurarii calitatii analizelor facute pentru identificarea contaminantilor din produsele din alimentatia umana si animala. Pentru stabilirea normelor comerciale, contaminantii trebuie sa fie corect identificati si cantitatile determinate sa fie scazute. Micotoxinele nu fac exceptie de la aceste reguli si analiza lor prezinta dificultati particulare in ceea ce priveste obtinerea esantioanelor reprezentative iar analiza trebuie sa permita identificarea nivelurilor scazute de micotoxine (sub 500 ppm).

Esantionarea constitue o etapa cruciala in determinarea continutului de micotoxine dintr-un lot de produse alimentare. Deoarece cantitatea de micotoxina nu este proportionala cu cantitatea de mucegaiuri prezenta, sunt foarte rar distribuite uniform in esantion. Contrar metodelor analitice, sistemele de esantionare nu pot face obiectul incercarilor interlaboratoriale si in general, un plan de esantionare este propus pe baza unui studiu statistic al repartitiei toxinelor masurate, apoi el este adoptat in mod oficial.

Publicatia colectiva a UNDP si FAO a definit clar procedurile de esantionare pentru diferite micotoxine. Se tine cont de tipul produsului si de dimensiunea lotului. In fiecare caz, numarul minim de subesantioane prelevate este precizat, ca si dimensiunea unitara minima a fiecaruia dintre ele. In plus, cantitatea subesantionului prelevat pentru analiza si modul in care este prelevat sunt specificate. Comisia europeana a editat o directiva in care se specifica metodele analitice de esantionare pentru controlul oficial la nivelul anumitor contaminanti in produsele alimentare. Procedura de esantionare poate fi rezumata intr-o secventa de sapte etape, indicate in figura nr.10

Figura 10. Etapele esantionarii

Scopul esantionarii Identificarea punctelor de esantionare Identificarea loturilor Alegerea metodei de esantionare Prelevarea esantioanelor Prepararea esantionului Conditionarea esantionului

Inainte de toate, trebuie sa se determine cu precizie scopul esantionarii si apoi se identifica punctele de esantionare. Modul de esantionare difera in functie de modul in care produsele sunt depozitate in vrac sau in ambalaje (saci, cutii metalice, butelii). Odata ce modul de conditionare a fost determinat, trebuie sa se localizeze cu precizie, punctele de esantionare. A treia etapa consta in identificarea loturilor care trebuie sa fie reprezentativa pentru sistemul analizat. Nu trebuie omisa metoda de esantionare care trebuie sa fie cat mai apropiata de analiza noastra, se disting trei tipuri de metode:

      Esantionare uniforma

In acest caz, se preleveaza o cantitate mica de proba din fiecare portie. In acest tip de esantionare, cantitatea prelevata este testata. Esantioanele trebuie sa fie deci reduse; aceasta procedura este numita divizare si este realizata de un divizor care preleveaza o fractiune identica din fiecare esantion in parte.

      Esantionare selectiva

Acest tip de esantionare presupune prelevarea partilor cele mai susceptibile a fi contaminate din lot. Aceasta tehnica se aplica de exemplu in cazul unui lot de cereale unde investigatia se va face doar pe granele care prezinta un stadiu avansat de mucegaire.

           Esantionare aleatorie

Acest tip de esantionare se efectueaza in cazul in care e nevoie de multe esantioane, de calitate diferita, care provin dintr-un lot neuniform. La aceasta tehnica, numarul esantioanelor, cantitatile lor totale si perioada de prelevare nu sunt determinate inainte de esantionare. Esantionarea strict aleatorie este complicata, si se face apel la tehnicile complexe de prelevare aleatorie. Prelevarea esantionului reprezentativ pentru lot este urmatoarea etapa a esantionarii. Cea de-a sasea etapa consta in prepararea esantionului, mai bine spus, separarea esantionului de impuritatile de dimensiuni mari pe care le contine. Ultima etapa presupune conditionarea esantionului in vederea determinarilor. In mod frecvent, esantioanele reprezentative cantaresc intre 3 si douazeci kilograme.

1.1.1 Variante de esantionare, de pregatire a esantionului si analitice

Se poate spune ca etapa de esantionare este de obicei sursa cea mai mare de erori in secventa analitica, mai bine spus in secventa de esantionare, prepararea esantionului si analizei. Varianta( , exprimata de reprezentativitatea esantionului trebuie sa fie cat se poate de scazuta, sau cel mult egala cu suma variantelor de esantionare (S_s²), de preparare a esantionului (S_sp²) si de analiza (S_a²):

St - S_s + S_Sp + S_a

Determinarea acestor variante se poate face in maniera empirica plecand de la formule stabilite in prealabil. De exemplu, in cazul arahidelor, Whitaker si colaboratorii sai au stabilit urmatoarele relatii:

S_s²= (49,0546*M_L^U955 - 0,39 M_L^1,7867) /W_s

Unde S_s este varianta esantionarii

M_L este concentratia in aflatoxina in lot in ppb

W_s este masa de arahide in esantion in kg

S_sp²= (0,978 M_S^1J867-0,0178 M_s¹'⁹³³⁹)/W_sp

Unde S_sp² este varianta de preparare a esantionului

M_s este concentratia in aflatoxine in esantion in ppb

W_sp este masa de arahide macinata in subesantion in kg

S_a²= (l/na)*(0,00482 M_SS^1J518)

Unde S_a² este varianta analitica pentru analiza HPLC

na- este numarul de analize repetate M_ss este concentratia de aflatoxina in subesantion in ppb.

. Conceptul si evaluarea unui plan de esantionare

Factorii urmatori sunt esentiali in stabilirea unui plan de esantionare:

tipul de marfa

concentratia maxima in toxine permisa in lot

concentratia maxima permisa in esantion (concentratia critica)

dimensiunea esantionului

numarul subesantioanelor;

numarul esantioanelor;

metoda de obtinere a esantionului;

metoda analitica;

Trebuie sa se stie ca exista doua tipuri de riscuri legate de planul de esantionare: riscul producatorului (Producer Risk, PR), care este acela de a respinge un lot sigur, si cel al consumatorului (Consumer Risk, CR), care este acela de a accepta un lot contaminat. Dupa determinarea partii relative a fiecaruia dintre cele doua riscuri se poate construi o curba unica numita curba caracteristica de operare (Operating Characteristic curve, OC curve) care pe abscisa are reprezentata probabilitatea [P(M)] ca planul de esantionare sa accepte un lot in functie de concentratia in aflatoxina M in lot. Forma acestei curbe va fi influentata de urmatorii parametri:

concentratia critica permisa in esantion;

marimea esantionului;

marimea subesantionului si gradul de fragmentare;

metoda analitica (tipul si numarul analizelor).

Probabilitatea ca un lot sa fe acceptat se poate exprima astfel: P(M)=p(X<Xc/M)   

Unde X este concentratia in toxina a esantionului

Xc este concentratia critica a esantionului

M este concentratia in aflatoxina a lotului.

Pentru analiza micotoxinelor, se vor prelua cate 4 esantioane identice cantitativ:

- primul pentru analiza propriu-zisa;

- doua pentru eventualele analize complementare;

- ultima este pastrata ca referinta

Dupa principiul Gafta Rules, daca cantitatea de micotoxina gasita in prima proba este mai

mare de 50% fata de limita autorizata, cea de-a doua analiza va fi efectuata pe cel deal doilea esantion. Daca rezultatele furnizate de aceasta data sunt inferioare limitelor, atunci, lotul va fi acceptat. Daca ce-a de a doua analiza prezinta valori mai mari decat normele tolerate dar inferioare primei probe, se va realiza o noua analiza pe cel de al treilea esantion. Daca rezultatele celei de a treia analiza sunt conforme cu normele in vigoare, lotul este acceptat, daca nu este respins.

Metodele care permit evidentierea micotoxinelor in produsele alimentare sunt scindate in doua categorii calitative si cantitative mentionand in egala masura si "testele kit' care permit analiza pe teren si furnizeaza date referitoare la prezenta sau absenta contaminantilor, dar trebuie sa fie confirmata de o analiza complementara de laborator.

Cele din urma, reprezinta un protocol recunoscut si normalizat de AOAC (Association of Official Analytical Chemist). Totusi, inainte de a fi normalizat, un protocol de analiza propus de un laborator trebuie sa fie validat prin teste iterlaboratoriale, organizate dupa normele ISO 43.

Diferitele metode de referinta se pot clasa dupa principiul lor fundamnental de functionare in tehnici fizico-chimice sau imunochimice; totusi noi le vom imparti in functie de performanta lor, in tehnici calitative: minicoloanele, coloanele de imunoafinitate, testul ELISA (poate fi considerat si test cantitativ); si tehnici calitative: cromatografie in strat subtire (TLC), cromatografie gazoasa (CG) si cromatografie lichida de inalta rezolutie (HPLC).

2. Metode calitative

In aceasta sectiune vom trata metodele care in general sunt folosite ca metode rapide de detectie a micotoxinelor.

Aceste metode sunt folosite ca etape prealabile de purificare a micotoxinelor. Dupa cum stim, metodele calitative folosesc fluorometria cu lumina UV pentru a determina concentratia molara a solutiei. Pentru interpretarea corecta a masurilor realizate, ne vom folosi de doua legi care descriu absorbtia luminii de materie:

Legea lui Lambert A = log

Legea lui Beer A= Cd

Unde:    A = absorbanta sau densitatea optica a solutiei;

I = intensitatea luminii emise

Io = intensitatea luminii transmise

C = concentratia substantei absorbante

= coeficeintul de extinctie al substantei absorbante

In practica, in cazul unui spectofotometru UV cu un fascicol, scala absorbantei este adusa la zero cu un solvant folosit ca martor. Celula care contine solutia de analizat este apoi plasata in spectrofotometru si citirea poate incepe. Fiecare micotoxina are o valoare a absorbantei bine specificata.

Tabel 19. : Parametri spectrofotometrici pentru diferite micotoxine

2.1. Metode imunologice

Testele imunologice constituie astazi metodele rapide de detectie a aflatoxinelor si a altor micotoxine in alimente. Anticorpii policloni si monocloni folositi sunt agentii de legatura folositi. Se stie ca micotoxinele sunt molecule non antigene cu masa moleculara mica, anticorpii policloni sunt produsi indirect prin raspunsul imunitar al animalelor la un complex micotoxina-proteina. Raportul molecular micotoxina-proteina este foarte important pentru intensitatea raspunsului imunitar. Pozitia si tipul de legatura intre toxina si proteina sunt de asemenea critice. Anticorpii monocloni sunt secretati prin fusiunea celulelor in splina soarecilor si legarea celulelor miceliene datorita polietilen glicolului. Imunogeneza este administrata prin injectari repetate de cantitati mici de proteina (40-300 μg).

Recunoasterea imunologica este bazata pe complementarismul spatial al grupelor specifice al antigenelor cu cei doi anticorpi. Anticorpii sunt reactivul cheie in testul immunologic si trebuie sa fie obligatoriu corect preparat si caracterizat. Caracteristicile utile pentru selectionarea unui anticorp convenabil sunt: constanta de afinitate, specificitatea si randamentul.

Se cunosc trei tipuri de teste imunologice : Testele RIA (radioimmunoassays), testele ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), si testele pe coloana de imunoafinitate. In ultima categorie sunt incluse minicoloanele sau coloanele de imunoafinitate.

2.1.1. Testele RIA

In testele RIA, aflatoxina este marcata din punct de vedere al radioactivitatii. Aflatoxina nemarcata sau aflatoxina in solutie test si aflatoxina marcata intra in competitie pentru numarul limita de legaturi la anticorpi. Cantitatea de aflatoxina in esantion este invers proportionala cu cantitatea de aflatoxina marcata in solutie. Avantajul acestor teste este acela ca necesita o cantitate scazuta de anticorpi. Prezinta totusi si dezavantaje in ceea ce priveste radioactivitatea, folosirea marcajelor izotopice.

2.1.2 Testele ELISA

Doua formate principale ale testelor ELISA sunt dezvoltate: testele competitive si testele non-competitive. In testul ELISA tipic, legatura unui complex micotoxina-enzima cu anticorpi imobilizati este inhibata prin prezenta micotoxinei in solutia test. Enzimele legate, catalizeaza transformarea substratului intr-un complex colorat. Intensitatea culorii este invers proportionala cu concentratia de aflatoxine. Peroxidaza care catalizeaza oxidarea substratului tetrametilbenzidina intr-un complex bleu este enzima de marcaj cel mai des intalnita. Metoda ELISA este frecvent intalnita in cazul laboratoarelor centrale unde sunt frecvent realizate numeroase teste. Pentru o viziune rapida si tot odata detaliata a variantelor metodei, este prezentat tabelul 2.12.

Principiul metodei ELISA

Testul se bazeaza pe reactia antigen - anticorp. Godeurile de microtitrare sunt acoperite cu anticorpi captura, directionati impotriva anticorpilor anti - micotoxina. In fiecare godeu, atat pentru standard, cat si pentru proba, se adauga conjugatul enzimatic si anticorpii anti - micotoxina.

Micotoxina libera si conjugatul enzimatic concureaza pentru siturile de legare ale anticorpilor de acoperire ai godeurilor (metoda imunoenzimatica competitiva).

Conjugatul enzimatic nelegat este indepartat in faza de spalare. Se adauga substrat/cromogen, observandu-se virarea culorii de la rosu la albastru. Adaugarea reactivului de stopare al reactiei determina modificarea culorii albastre in galben. Citirea probelor se realizeaza la 450 nm. Absorbanta este invers proportionala cu concentratia micotoxinei din proba.

Tabel 20. : Aplicatii ale metodei ELISA in determinarea micotoxinelor in alimentatie

2.2. Metode de imunoafinitate

Coloanele de imunoafinitate sunt preparate prin adsorbtie de anticorpi pe un suport inert (tuburi de microtitrare , membrane, bile de sticla). Micotoxinele sunt prelevate de solutiile test prin anticorpi imunospecifici. Dupa ce impuritatile din cartus au fost spalate, micotoxinele sunt desorbite in metanol si transferate pe coloana in faza inversa pentru a fi separate. Apoi determinarea se face cu UV. Folosirea coloanelor de imunoafinitate pentru prelevarea si concentrarea micotoxinelor prezinta mai multe avantaje: cresterea selectivitatii, posibilitatea prelevarii din volume mari si asocierea cu alte tehnici analitice. Aceasta tehnica prezinta de asemena avantajul de a fi foarte rapida (10-15 minute) si nu presupune necesitatea unui personal calificat. Inconvenientul major al acestei tehnici este folosirea unei cantitati importante de anticorpi. Trebuie specificat faptul ca in cazul anumitor micotoxine ca aflatoxinele, o derivatie prealabila trebuie sa fie realizata pentru a putea folosi tehnica fluorimetrica cu lumina UV.

2.2.1. Minicoloanele

Aceasta metoda a fost inventata in 1976 in Tailanda. Aflatoxina este extrasa in metanol apos, urmata de o limpezire prin precipitare cu acetat de zinc sau sulfat de amoniu saturat. Aceasta ultima metoda permite mai ales reducerea continutului de specii interferate. Aflatoxina este apoi pusa in fluorisilul din minicoloana. Fluorescenta este apoi detectata cu ajutorul Luminii UV la 365 nm si comparata cu standardele. Metoda care face referire la calibrarea aflatoxinelor in cereale cu o limita de detectie de 20 ppb este metoda Holaday-Velasco numita si minicoloane HV. Aceasta metoda a fost acreditata in 1980 de Federal Grain Inspection Service. Coloana (25cm-6mm) este realizata din aluminiu, silicagel si din fluorisil. Sulfatul de sodiu sau calciul anhidru este de asemenea folosit pentru a inlatura toate urmele de umiditate. Metoda necesita o purificare prealabila a extractului, care se face de obicei printr-o simpla filtrare.

2.2.2.. Coloane de imunopurificare

Spre deosebire de minicoloane care sunt de obicei folosite ca metode de calibrare, coloanele de imunoafinitate normale sunt mai degraba folosite in timpul unei purificari prealabile a esantionului inaintea dozarii cantitative prin HPLC, de exemplu.

Imunopurificarea consta in purificarea aflatoxinelor sau ochratoxinelor plecand de la extractia unui esantion prin trecere pe coloane de imunoafinitate care contin un suport prevazut cu anticorpi dirijati in mod special impotriva micotoxinelor.

Metode cantitative

3.1. Teste kit

Testele kit permit determinarea continutului de micotoxine in laboratoare nespecializate. Testele kit folosite functioneaza dupa doua metode: metoda cromatografiei in strat subtire si metoda imunologica. Avantajul folosirii testelor kit TLC este acela ca un singur test poate fi folosit pentru determinarea mai multor micotoxine. Testele kit bazate pe metodele imunologice au avantajul usurintei si rapiditatii metodei.

3.2 Cromatografie in strat subtire (TLC)

Cromatografia in strat subtire este o metoda folosita incepand cu anul 1990 pentru analiza aflatoxinelor. Pentru cromatografia in strat subtire limita de detectie pentru dozarea aflatoxinelor este de 2 ppb, iar cea pentru tricotecine limita este de 50 ppb. De obicei, aceasta metoda este urmata de un test ELISA in cazul in care furnizeaza un raspuns pozitiv. S-a aratat ca cromatografia in strat subtire poate fi aplicata in egala masura si in cazul analizei tricotecenelor, in particular a desoxinivalenolului (DON) si al zearalenonei (ZON).

T    Principiul metodei

Extractia micotoxinelor in solventi organici si separarea lor prin cromatografie in strat subtire, identificarea micotoxinelor separate in lumina ultravioleta la lungimile de unda de 254 nm si 366 nm fata de substanta etalon si confirmarea prezenzei micotoxinelor identificate in spoturi prin reactii de derivatizare.

3.3 HPLC (high performance liquid chromatography- cromatografie cu lichid de inalta performanta)

Metoda HPLC realizeaza cuantificare de mare precizie. Este o metoda de referinta si poate realiza cuantificarea compusului de analizat aflat in cantitati foarte mici (ng). In cazul metodei HPLC dezvoltate limita de detectie poate ajunge pana la 0,02 ppm, in timp ce limita de cuantificare este de 0,06 ppm. HPLC este o metoda folosita pentru analiza numeroaselor micotoxine ca: zearalenina, ochratoxina A, fumonisina B1, vomitoxina si alfatoxine. Desi este o metoda cu un pret ridicat, care necesita experienta si timp, aceasta metoda este foarte mult folosita ca tehnica de confirmare in cazul determinarilor folosind cromatografia in strat subtire sau folosind teste de imunoafinitate. Avantajele acestei metode raportata la cromatografia in strat subtire: precizie. Exista doua tipuri de cromatografie cu lichid de inalta performanta: cu faza normala si cu faza inversa (RP-HPLC). Daca prima a avut o perioada de glorie acum 20 de ani, astazi cel mai des folosita este cea de a doua. Totusi trebuie specificat faptul ca in cazul folosirii (RP-HPLC), fluorescenta aflatoxinelor B1 si G1 scade.

Ansamblul cromatografic HPLC este un sistem compus dintr-un modul de separare si unul de detectie.

Modulul de separare - controleaza urmatorii parametri cromatografici: programare metoda, compozitie solvent, viteza de elutie, spalarea garniturilor, injectia probei, semnalarea a unor evenimente externe, operarea detectorului prin interfata IEEE- 488, termostatare coloana, termostatare probe, degajare eluent. Modul de separare consta din doua sisteme- un sistem de administrare a solventului (compus din 4 pompe si o valva de realizare a gradientului) si un sistem de administrare a probei (compus din autosampler cu 5 carusele a cate 24 de flacoane si un injector automat)

Modul de detetie - este un detector performant UV/Vis, cu doua canale, destinat aplicatiilor HPLC si opereaza in domeniul 190- 700 nm. Soft-ul prin intermediul caruia se fac achizitiile de date, cat si prelucrarea lor, este MILLENIUM.

Proba de la care se pleaca este reprezentata de cereale macinate. Fiind o proba solida, trebuie sa se faca extractia prealabila a compusului de analizat, DON fiind solubil in solventi folositi in mod curent pentru extractie.

Deoarece extractul este foarte complex este necesara realizarea unei separari prealabile, care are rolul de a inlatura eventualii interferenti, dar si de a proteja coloana cromatografica.

Pentru separare s-a optat pentru utilizarea a doua tipuri de coloane, pe de o parte, coloane de iminoafinitate DONprep, care leaga micotoxina, la trecerea acesteia prin coloana, de anticorpul specific aflat in umplutura coloanei, iar pe de alta parte, coloane multifunctionale, Mycosep 225 si coloana Multisep 216, care lasa sa treaca micotoxina prin coloana, in timp ce compusi de interferenta sunt retinuti in umplutura coloanei.

In selectarea metodei HPLC si a conditiilor initiale se porneste de la proba de analizat. In urma extractiei si a separarii se obtine o proba care contine molecule cu mase moleculare mici. Caracteristicile chimice ale compusului de analizat, DON-ul, indica abordarea unei cromatografii cu faza inversa.

Alegerea coloanei de separare se face cunoscand ca DON-ul are masa moleculara mai mica de 2000, este solubil in solventi aposi, nu este ionic si nici polar. Coloana de separare aleasa pentru analiza este Symetry C18, avand lungimea de 25 cm si diametrul interior de 0,46 cm. Faza stationara este octadecilsilanul, care prezinta o retentie foarte buna deoarece lungimea lantului hidrocarbonat grefat pe suportul silanic este mare (18 atomi de carbon). Dimensiunea porilor este de 100 , iar dimensiunea particulelor este de 5 μm, optiunea fiind justificata de masa moleculara mica a compusului de analizat.

Partea a doua PARTEA EXPERIMENTALA

1. Analiza microbiologica a cerealelor

Analiza microbiologica este indispensabila atat pentru a asigura produsului o calitate si o conservabilitate mai bune, cat si pentru a garanta calitatea igienica si siguranta consumatorilor. Pentru tehnicile de analiza microbiologica, cantitative si calitative s-au cumparat din Piata Centrala Galati cereale: porumb, orz si secara destinate consumului uman si animal. Probele au fost evaluate calitativ pentru a studia gradul de contaminare cu mucegaiuri.

Evaluarea calitativa- aprecierea aspectului coloniilor dezvoltate prin cultivarea boabelor de cereale pe medii selective (MMA) , in conditii de aerobioza la temperatura de 25˚ C.

     Materiale necesare

S-au folosit 15 probe de porumb, 14 probe grau, 13 probe orz si 10 probe de secara, medii de cultura specifice (must de malt cu agar), placi Petri.

     Mod de lucru

Mediul de cultura de MMA este fluidificat, repartizat in placi Petri. Dupa solidificarea mediului se adauga in fiecare placa cu o penseta sterila boabe de porumb, grau, orz si secara. Placile sunt termostatate la 25C timp de 5 zile. Coloniile de mucegai dezvoltate in placile Petri sunt izolate (metoda in strii) si analizate microscopic si macroscopic. Dupa termostatare s-a observat ca gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai este relativ mare ( tabel nr.1.) Astfel din 15 probe de porumb analizate, 80% au fost contaminate cu mucegai, la 14 probe de grau 71 % au fost contaminate cu mucegai, din 13 probe de orz 85 % au fost contaminate si din 10 probe de secara 70% au fost contaminate cu mucegai.

Tabel 21. Gradul de contaminare a cerealelor cu mucegai

Identificarea microscopica s-a realizat cu ajutorul preparatelor umede.

     Obtinerea preparatelor umede

Principalele etape pentru executarea unui preparat umed:

pregatirea lamei si lamelei- lama curata si degresata se sterilizeaza trecand ambele fete prin flacara becului de gaz. Lamela se sterge cu hartie de filtru;

realizarea suspensiei de celule pe lama - se depune o picatura de apa sterila pe lama de sticla sterilizata, in zona centrala. Pentru recoltarea celulelor aflate in medii lichide se foloseste ansa sau pipeta sterila, iar pentru recoltarea microorganismelor aflate pe medii dense (solide sau solidificate) se foloseste firul metalic.

realizarea preparatului intre lama si lamela - dupa obtinerea suspensiei de celule, lamela curata se sprijina si se deplaseaza pe lama la un unghi de 45, pana cand devine tangenta la picatura, apoi se lasa sa cada peste aceasta. Lichidul in exces se absoarbe pe marginile lamelei cu hartie de filtru.

Un preparat bun nu trebuie sa prezinte bule de aer, acestea putand determina aglomerari de celule si ingreuna studiul preparatului microscopic.

Dupa analiza microscopica si macroscopica a coloniile de mucegai dezvoltate pe mediul de cultura dupa perioada de termostatare s-a observat prezenta urmatoarelor specii de mucegai Aspergillus sp., Penicillium, Fusarium, Mucor si Rhizopus (Fig.nr.11,12,13, 14,).

In urma graficilor obtinute s-a observat ca in probele de porumb a predominat intr-un procent de 60% Aspergillus sp. In comparatie cu celelalte specii care au fost intr-un procent mai mic Penicillium 20%, Fusarium 13% si Rhizopus 7%. In comparatie cu probele de grau procentul de Aspergillus a fost mai mic de numai 36% dar a predominat Penicillium intr-un procentaj de 43% si procentul cel mai mic de 21% Fusarium.

In probele de orz au fost observate mai multe speciile de micotoxine in numar de 5 iar procentul cel mai mare avandu-l tot Aspergillus ca si in probele de porumb celelalte avand un procent de Penicillium 23%, Fusarium 15%, Rhizopus 15% si Mucor 8%. In probele de secara s-au observat doar 3 specii de micotoxine in care Fusarium a reprezentat 50% , Aspergillus 30% si Penicillium 20%.

Fig. 11. Principalele specii de mucegai prezente pe porumb

Fig. 12 Principalele specii de mucegai prezente pe grau

Fig.13 Principalele specii de mucegai prezente pe orz

Fig.14 Principalele specii de mucegai prezente pe secara

2. Evidentierea mucegaiurilor producatoare de aflatoxine

Metoda se bazeaza pe cultivarea mucegaiurilor izolate sub forma de culturi pure din alimente mucegaite, pe mediu optim pentru elaborarea aflatoxinelor si determinarea calitativa sau semicantitativa a micotoxinelor prin cromatografie si studiu in lumina U.V cu lungimea de unda 365 nm.

Modul de lucru: Din culture pure ale mucegaiurilor din genul Aspergillus de pe cereale, cu ajutorul firului se recolteaza cantitati mici de spori si se fac inoculari in zona centrala a placilor Petri in care se afla in prealabil repartizat mediul Hara cu agar( tabel.nr.2.) Placile se incubeaza la 28 C timp de 5-7 zile, conditii optime pentru elaborarea aflatoxinelor. Dupa acest interval, placile se expun la radiatii ultraviolete cu λ= 365 nm. Deoarece culturile analizate au prezentat o zona fluorescenta in jurul coloniei (fig nr.15), se presupune ca mucegaiul prezinta caracter toxicogen .

Tabel nr.22. Compozitia mediului HARA

Fig.nr.15 Coloniile speciei Aspergillus cultivate pe Mediu HARA incubate la 25C

timp de 7 zile observate cu si fara lumina UV

Analiza calitativa a aflatoxinelor

Pentru analiza calitativa au fost realizate patru medii de cultura, un mediu lichid sintetic (tabel nr.23) si trei medii solide pe baza de cereale (tabel nr.24).

Mediul pe baza de cereale a fost obtinut prin fierberea amestecului de cereale cu apa timp de 30 minute, filtrat si s-a adus la 1 litru cu apa distilata din fiecare mediu cate 100 ml au fost repartizate in pahare Erlenmeyer si sterilizate timp de 20 min. La 121C.

Tabel 23 Compozitia mediului lichid sintetic

Tabel 24 Compozitia mediului pe baza de cereale

3.1 Pregatire inocul

Mucegaiul a fost crescut 7 zile pe MMA la 25 C, a sporulat. Sporii au fost suspendati in apa distilata cu 0,005 % agent Tween 80. Cu camera Thoma s-au numarat sporii si pentru a obtine o suspensie cu spori pentru inoculare s-au realizat dilutii decimale.

v     Numarare cu Camera Thoma

Pentru numarare se plaseaza o picatura din suspensia de ositiv de analizat pe platforma centrala, in dreptul suprafetei delimitate. Peste suspensie se plaseaza o lamela care se sprijina pe cele doua platforme la terale si astfel intre lamela si citometru se creeaza o pelicula de lichid cu inaltime egala cu denivelarea platformei centrale (0 mm). Astfel, volumul de lichid plasat pe fiecare patratel elementar este Preparatul obtinut se studiaza la microscop cu obiectiv cu grosisment x40, cand in campul microscopic poate fi vizualizat un grup de 16 patratele elementare, din care se numara celulele a caror suprafata se afla mai multe campuri microscopice (= 100) si se calculeaza numarul mediu de celule pe un patratel elementar:

n =

Numarul de celule prezente intr-un de suspensie de analizat se determina cu formula:

N= n4 k

in care : n este numarul mediu de celule pe un patratel elementar;

k- coeficientul de dilutie

Inoculare si incubare

In mediu proaspat preparat s-a inoculate o suspensie cu spori. Mediile au fost agitate 10 min. Pentru repartizarea sporilor in tot mediul. Mediile inoculate au fost termostatate la 28C, timp de 14 zile, stationar(fig. nr 6).

Fig. 16 Mediile de cultura dupa perioada de termostatare

Extractie

Dupa terminarea perioadei de termostatare, s-a adaugat la fiecare proba 100 ml chloroform apoi s-a agitat timp de 24 h, 200 rot./min la 25C. Separarea de cloroform s-a facut cu palnii de separare. Extractia cu cloroform se va repeta si cele doua extracte se vor amesteca si vor fi analizate prin cromatografie in strat subtire. Extractele obtinute au fost examinate la lampa U.V pentru a vedea fluorescenta care indica prezenta aflatoxinelor.

   

Fig. 19 Extractele obtinute observate cu si fara lumina U.V

Aparatura necesara pentru cromatografia in strat subtire

camera de vizualizare in ultraviolete cu filter de 254 nm si 366 nm;

placi pentru cromatografie in strat subtire gata preparate cu strat de silicagel 60 G de 0.3 mm grosime sau placi sticla preparate in laborator cu dimensiunile de 200x200 mm sau 100x200 mm;

tanc pentru cromatografie sau camera cromatografica in forma de U (vas paralelipipedic din sticla);

Shaker

rotovapor;

seringa Hamilton 10 μl;

cilindri gradati de 50 ml, 100 ml, 250 ml;

sablon pentru aplicarea spoturilor pe placa;

Reactivi

cloroform;

sulfat de sodiu anhidru;

aflatoxine: B

amestec de acetona -apa 85:15 (V/V);

amestec alcool metilic -apa 85:15 (V/V);

system de de solventi de developare: toluene- acetat de etil acid formic in proportie de 6:3:1(V/V/V);

silicagel G 60

clorura de metilen acetona (98: 2)

amestec eter etilic eter de petrol(20 :30)

v     Prepararea sistemului de cromatografie in strat subtire

Placile de sticla s-au spalat bine cu detergent, s-a clatit bine cu multa apa curenta, apoi cu apa distilata si s-a uscat. Inainte de intinderea absorbantului s-a sters cu tampon de tifon cu alcool sau acetona, apoi cu tifon curat si uscat. Pe placile astfel pregatite s-a aplicat amestecul absorbant cu ajutorul dispozitivului de aplicat absorbantului pe placa. Pentru a obtine placi cu strat absorbant bine fixat s-a substituit 20 ml amidon 10 %. Grosimea stratului adsorbant aplicat pe placa trebuie sa fie de 0.3 mm.

Placile s-a lasat sa se usuce la temperature camerei in pozitie orizontala timp de 1.2 h. Apoi sunt activate prin introducere in etuva, la 110C, timp de 1 h, dupa care s-a scos imediat, sau s-a putut pastra intr-un exsicator cu clorura de calciu. Daca s-a tinut mai mult inainte de intrebuintare trebuie activate din nou.

v     Aplicarea spoturilor pe placa cromatografica

Placa cromatografica pregatita, s-a asezat pe o suprafata plana, s-a marcat linia de start la 2 cm de la marginea placii si s-a marcat linia pana la care trebuie sa migreze ositiv solventului care se situeaza la 15 cm fata de linia de start.

Reziduul ramas la evaporare conform punctului 1, s-a reluat cu solvent de spotulare din care s-a luat 10 μl cu o micropipeta si s-a aplicat pe placa cromatografica sub forma de spoturi rotunde cu diametrul de 5 mm.

Pe o placa cromatografica cu dimensiunile de 200x200 mm s-a putut aplica maximum opt spoturi la o distanta de minim 1 cm fata de marginile laterale. Din solutiile etalon de micotoxine cu concentratia de 1 mg/ml si din proba de analiza s-a aplicat cu o microseringa spoturi de 10 l solutie pe placa cromatografica in cele pozitii posibile astfel:

in pozitia 1 se aplica 10 l solutie de aflatoxina B (solutia etalon Ridasreen cu o concentratie de aflatoxine totale de 4050 ppt achizitionat de la firma Diamedix. S.R.L fig.nr.10);

in pozitia 2 se aplica 10 μl solutie din prima proba de analiza;

in pozitia 3 se aplica 10 l solutie din a doua proba de analiza;

in pozitia 4 se aplica 10 l solutie din a treia proba de analiza;

in pozitia 5 se aplica 10 μl solutie din a patra proba de analiza

Fig.17.Solutia etalon de aflatoxina

v     Developarea

In tancul de developare s-a introdus amestecul de solventi de developare pana la o inaltime de max 5 mm. Partea interioara a tancului s-a captusit cu hartie de filtru care sa imbibe cu solventii de developare pentru a asigura o atmosfera saturata cu vaporii developantului si pentru a evita evaporarea acestuia de pe placa in timpul developarii. Dupa executarea acestor operatii tancul s-a inchis, s-a lasat 20.30 minute pentru saturarea atmosferei cu vapori. Dupa care s-a introdus placa cromatografica cu capatul pe care s-au aplicat spoturile in sistemul de solventi de developare din tanc. S-a inchis etans cu capacul si s-a lasat la developat pana cand frontul solventului a atins linia marcata la 15 cm de linia de start.

S-a scos placa, si s-a uscat la temperatura camerei timp de cateva minute.

Fig. 18 Operatia de developare

v     Identificarea micotoxinelor

Pe placa cromatografica s-a examinat la lampa U.V (fig.18) si s-a incercuit zonele cu fluorescenta asemanatoare cu a etaloanelor si s-a pulverizat cu solutie de derivatizare. Dupa pulverizare, placa cromatografica s-a introdus in etuva timp de 2..3 minute, la o temperatura de 60C. Se examineaza din nou placa la lumina ultravioleta si daca fluorescenta a suferit modificari similare celor din etaloane s-a confirmat prezenta micotoxinei in proba analizata. Tipurile de micotoxine, raportul zonelor de fluorescenta asemanatoare etaloanelor si culoarea fluorescentei in ultraviolete sunt redate in tabelul 25. Raportul zonelor de fluorescenta asemanatoare cu cele ale etaloanelor (Rt) se calculeaza cu formula :

Rt = d /d

In care : d - distanta dintre linia de start si centrul zonei fluorescente a micotoxinei, in mm;

d - distanta dintre linia de start si linia pana la care a migrat frontal solventul, in mm;

Fig. Nr. 18 Lampa U.V

v     Derivatizarea si confirmarea micotoxinelor

Pentru confirmarea unei micotoxine, se stabileste pe placa cromatografica zona asemanatoare cu cea a etalonului micotoxinei respective si se pulverizeaza cu solutie de derivatizare. Dupa pulverizare zona si etalonul devin de culoare careacteristica micotoxinei. Dupa realizarea analizelor se intocmesc buletine de analiza in care trebuie sa se mentioneze urmatoarele:

datele necesare pentru identificarea lotului;

rezultatele obtinute;

SR 9597/19:1993

Tabel 25 Caracteristici de identificare a micotoxinelor prin cromatografie in strat subtire