Etapele reprogramarii microorganismelor prin tehnologia ADN recombinant (clonarea moleculara)

Etapele reprogramarii microorganismelor prin tehnologia ADN recombinant (clonarea moleculara

Ingineria genica la nivel celular, prin fuziunea protoplastilor realizeaza transferul necontrolat al genelor de la o celula la alta. Metodele ingineriei genice, bazate pe actiunea enzimelor de restrictie asigura clivarea controlata si obtinerea fragmentelor de ADN de dimensiunea genelor individuale. Ele ofera posibilitatea izolarii genelor si transferului lor in celula receptoare.

Tehnicile de inginerie genica moleculara sau tehnologia ADN recombinant, avand ca model transferul unor gene din celula animala, in celulele bacteriene, se desfasoara in urmatoarele etape:

l) Izolarea genei naturale sau sinteza chimica a moleculei de ADN care codifica molecula proteica cu semnificatie practica;

2) Selectia unui "vehicul" sau vector adecvat si insertia genelor straine in molecula vector si obtinerea unei molecule himere;

3) Transferul moleculei vector in celula bacteriana;

4) Selectia celulelor modificate genetic.

Obtinerea unei molecule hibride de ADN prin recombinare in vitro si amplificarea ei numerica intr-o populatie bacteriana se numeste clonare.

Pentru a fi perpetuate, genele clonate trebuie sa devina parte componenta a moleculei de ADN, care este replicata la fiecare ciclu de diviziune.

Prima etapa a clonarii moleculare este alegerea sursei donoare de material genetic si obtinerea fragmentelor de ADN. Sursa de ADN poate fi o celula procariota sau eucariota (fungica, vegetala, animala) sau un virus. Din celule se purifica ADN si ulterior, fragmentele utilizabile in etapa clonarii se obtin prin diferite metode, tinand seama de faptul ca fragmentele care se pot clona sunt relativ mici, intre l000-2000 perechi de baze. Un astfel de fragment trebuie sa contina secventa integrala a unei gene si cat mai putin ADN neinformational.

Fragmentarea ADN se realizeaza cu ajutorul enzimelor de restrictie. Marimea fragmentelor de ADN obtinute este determinata de marimea situsului de recunoastere a enzimei si de frecventa cu care situsul respectiv se intalneste de-a lungul moleculei de ADN. Cu cat situsul de recunoastere este mai mic, cu atat sansa repetarii sale este mai mare si fragmentele rezultate sunt mai mici. Dintr-un cromosom mamalian rezulta l0⁵ - l0⁷ fragmente, care se separa dupa dimensiuni.

Moleculele de ADN se pot fragmenta mecanic, prin agitare in suspensie, intr-un mixer special (waringblender) si rezulta fragmente de circa 3000 perechi de baze.

Tehnologia ADN recombinant a fost folosita si pentru clonarea unor gene, a caror identificare prin fragmentarea genomului nu este posibila, dar pentru care, in celula se gaseste ARNm. Din celula se izoleaza ARNm, iar prin transcriere inversa, in vitro se obtine o copie de ADN complementar (ADNc). Astfel, se elimina diversitatea moleculelor de ADN dintr-un amestec. Moleculele de ADNc sunt convertite la ADN dublu catenar.

ADNc se deosebeste de ADN genomic, deoarece ARNm este prelucrat prin clivare si inadire. Metoda este limitata la clonarea genelor de ADNc, al caror ARNm se gaseste in citoplasma, in cantitate semnificativa.

Daca proteina are dimensiuni mici, gena codificatoare se obtine prin sinteza chimica. Se determina secventa aminoacizilor si se sintetizeaza o molecula de ADN cu codonii corespunzatori. Genele astfel sintetizate au caracter continuu, sunt lipsite de introni si sunt adecvate transcrierii si traducerii in celula bacteriana: gena pentru somatostatina (un hormon de l4 aminoacizi).

In general, genele celulare eucariote sunt prea mari pentru a fi sintetizate chimic si spre deosebire de genele bacteriene, sunt adesea gene discontinui (mozaicate).

Alegerea "vehiculului" sau vectorului adecvat ca purtator si cuplarea cu fragmentul de ADN. Pentru ca fragmentul de ADN sa fie transferat in celula receptoare este necesar un purtator denumit vector sau vehicul de clonare, deoarece ADN din celula eucariota nu poate fi incorporat direct in cromosomul bacterian. ADN exogen nu are capacitate de replicare autonoma si nici nu se mentine in stare autonoma, deoarece este sensibil la actiunea nucleazelor citoplasmatice.

Vectorii sunt molecule de ADN cu capacitatea de replicare autonoma. De cele mai multe ori, vectorii sunt reprezentati de o plasmida sau de un fag temperat, ce pot sa lege fragmentul de ADN in care se gaseste gena ce urmeaza a fi clonata.

Vectorii ideali au urmatoarele proprietati:

sunt relativ mici;

se replica independent (autonom) in celula, deoarece au o origine a replicarii;

se purifica usor ca unitati intregi din acizii nucleici ai celulei gazda;

au situsuri de actiune a enzimelor de restrictie.

La nivelul unui situs de restrictie, genomul vehiculului de clonare va fi sectionat cu aceiasi enzima de restrictie, care a generat fragmentele de ADN strain, creind posibilitatea legarii celor doua genomuri.

Plasmidele naturale, ca si fagii nu indeplinesc toate conditiile enuntate. De aceea s-au creat noi vectori, pornind de la cei naturali. Plasmida pBR₃₂₂ este cel mai cunoscut vector de clonare si contine o cantitate minima de ADN. Plasmidele pot lega fragmente de l0-l2 kbp. Fragmentele mai mari tind sa fie instabile si pierd cea mai mare parte a ADN strain. Rata replicarii plasmidelor, scade odata cu cresterea dimensiunilor.

Un alt vector plasmidial este pUC₁₈, construita dintr-un replicon asemanator plasmidei Col E₁^.

Vectorii plasmidiali trebuie sa poarte markeri care sa permita selectia celulelor transformate: de exemplu, una sau mai multe gene de rezistenta la antibiotice. Plasmida pUC₁ poarta gena bla, care confera rezistenta la ampicilina. Al II-lea marker este gena β-galactozidazei. Celulele tranformate sintetizeaza β-galactozidaza, detectabila cu un substrat cromogenic (x-gal), care da culoarea albastra dupa ce este hidrolizat de β-galactozidaza. Coloniile transformate de vectorul plasmidial pUC₁ sunt albastre, iar celelalte raman albe.

Dintre fagi, cel mai utilizat vector este fagul λ care infecteaza E. coli. Genomul sau are circa 48 kb. Regiunea centrala, de 20 kb, poate fi inlocuita cu ADN strain, deoarece partea stanga (l9 kb) si cea dreapta (l0 kb) contin toata informatia genetica necesara replicarii fagului. S-a creat astfel o varietate de vectori fagici, care poarta l-20 kb de ADN strain, fara sa afecteze replicarea si impachetarea normala a cromosomului λ in fagii progeni. Diferenta esentiala fata de vectorul plasmidial este ca dupa introducerea ADN in celula bacteriana, trebuie cautate plajele de liza intr-o panza bacteriana.

Fagul λ, purtator al fragmentului de ADN strain, se multiplica in celulele de E. coli si formeaza genomuri concatemere, in care situsurile fagice cos, care semnifica impachetarea, sunt asezate la distanta de 50 kb. Mecanismul impachetarii, orientata de situsurile cos, nu distinge ADN fagic de cel strain. Astfel, lungimea moleculelor recombinate, impachetate, este conditionata de prezenta situsurilor cos pe molecula de ADN. Fagii purtatori ai fragmentului de ADN strain, sunt infectiosi pentru bacteriile sensibile, ca si fagul natural.

Al III-lea tip de vector, combina unele particularitati ale plasmidelor si fagilor si se numeste cosmid. Vectorii cosmizi sunt hibrizi intre plasmide (care isi pastreaza functia de replicare si markerii de rezistenta) si fagi, de la care pastreaza situsurile cos, ceea ce le permite sa fie impachetati in capsida fagica. Acesti vectori permit legarea si clonarea unor fragmente mari de ADN, de pana la 50 kbp.

Alegerea celulelor ca suport al clonarii genelor. Molecula hibrida sau himera, rezultata prin legarea ADN strain de vectorul de clonare, trebuie transferata intr-o celula bacteriana adecvata replicarii. Cel mai adesea, transferul s-a realizat in celulele de E. coli si B. subtilis.

Transferul propriu-zis se poate face pe una din urmatoarele trei cai:

transformare genetica, prin inducerea competentei artificiale a celulelor receptoare cu CaCl₂:

prin conjugare

prin transductie genetica

Consecutiv replicarii genelor clonate in substratul celular adecvat, s-au creat colectii de plasmide sau fagi, fiecare purtand un fragment de ADN, denumite "banci de gene". Intr-o banca ideala se va gasi intregul genom al organismului, ca un set de fragmente clonate independent. De regula, lipsesc unele fragmente de ADN, fie datorita lipsei situsurilor de actiune pentru enzimele de restrictie, fie pentru ca unele gene sunt letale pentru celula gazda.

Clonarea este o etapa complexa, atat din punct de vedere molecular, cat si al realizarii tehnice. Din punct de vedere molecular, clonarea corespunde grefarii genelor straine in celula receptor, replicarii si exprimarii lor in noua gazda. Din punct de vedere tehnic, clonarea consta in selectarea celulelor modificate genetic ale populatiei respective, care vor perpetua vectorul in generatiile de celule.

Clona celulara reprezinta o populatie de celule rezultata din reproducerea asexuata a unui organism, astfel incat toate celulele populatiei respective sunt identice din punct de vedere genetic si sunt identice cu celula parentala. Bacteriile reprogramate genetic sunt considerate tulpini mutante ale celulelor parentale, deoarece cel mult l% din materialul lor genetic este nou.

Posibilitatea clonarii genelor intr-un organism, caruia in mod natural ii lipseste informatia omologa a oferit o modalitate cu totul originala de a studia bazele moleculare ale organizarii genelor si reglarii lor, precum si calea modificarii organismelor prin modificarea cailor metabolice.

Spectrul de gazda a genelor clonate a fost extins la vectori ai celulelor eucariote: se folosesc plasmide ale levurilor sau ADN al unor virusuri infectioase pentru organismul animal. S-au obtinut vectori prin fuziunea a doi repliconi, unul bacterian si altul cu originea in celula eucariota, cu capacitatea de replicare, atat in celula bacteriana, cat si in celula eucariota.

Genele celulelor eucariote, clonate in celula bacteriana nu sunt transcrise de la promotorii proprii, deoarece acestia nu sunt recunoscuti de ARN-polimeraza bacteriana. De aceea, pentru exprimarea unei gene in celula bacteriana, este necesara cuplarea cu o secventa promotoare bacteriana.

O alta problema importanta este ca fragmentul de ADN generat de o endonucleaza de restrictie nu contine numai gena codificatoare a moleculei biologic active, ci si secventele care o flancheaza si care trebuie clivate. Eliminarea lor se face intr-o etapa suplimentara, denumita etapa subclonarii. Pentru aceasta, fragmentul de ADN recuperat dupa clonarea primara este supus clivarii cu diferite enzime de restrictie.

Aplicatii ale clonarii moleculare

Clonarea fragmentelor de ADN, purtatoare de informatie genetica a revolutionat studiul multor domenii ale biologiei. Cele mai importante sunt urmatoarele :

l. Cunoasterea organizarii genomurilor de dimensiuni mici este rezultatul clonarii ADN si al metodelor de scventiere a bazelor. S-a determinat secventa completa a bazelor in plasmide si a genomului mai multor virusuri.

2. Intelegerea geneticii celulei eucariote. Prin clonarea ADN si folosirea ADN clonat in tehnicile de hibridare, s-au evidentiat schimbarile ce au loc in organizarea genelor in timpul maturarii limfocitelor, a genelor ce determina schimbarile antigenicitatii tripanosomelor.

3. Producerea substantelor de mare valoare biologica. Celulele care primesc o gena clonata intr-un vector, pot sintetiza cantitati mari ale substantei codificate de gena respectiva.

4. Studiile de inlocuire a genelor si intelegerea mcanismelor reglarii activitatii genelor in celula eucariota. In acest sens, organismele transgenice sunt un exemplu elocvent. Ele rezulta prin injectarea in nucleul celulei, a unei gene clonate. Fragmentul de ADN clonat se integreaza la situsuri diferite in cromosomii celulei ou. Se ofera astfel posibilitatea studiului diferentierii celulare asupra expresiei genice, ca si a interactiunilor genice. O posibila viitoare aplicatie la om a metodologiei de clonare este terapia genica, prin introducerea unei gene clonate in celulele somatice ale unui organism (celule ale maduvei osoase sau ale liniei germinale), pentru a compensa un defect genetic.

Realizari ale biotehnologiei cu microorganisme. Domeniul care pare sa aiba cele mai multe avantaje ale biotehnologiei cu microorganisme reprogramate genetic este cel chimio-farmaceutic. Prin metodologia biotehnologica se produc hormoni, substante imunostimulatoare (sau adjuvante), capabile sa stimuleze raspunsul imun al organismului animal si uman.

Sinteza in celulele bacteriene, a unei poteine animale cu activitate biologica, presupune depasirea unor dificultati suplimentare celor obisnuite de clonare:

bacteriile nu prelucreaza ARNm transcris din ADN al unei gene eucariote si nu elimina secventele neinformationale (intronii):

nu cliveaza secventele suplimentare ale precursorilor proteinelor mature;

nu realizeaza glicozilarea proteinelor sintetizate.

Totusi, unele proteine specifice celulei eucariote sunt sintetizate de bacteriile reprogramate genetic, in forma lor activa. De exemplu, genele codificatoare ale interferonilor nu au secvente necodificatoare si in consecinta, ARNm nu trebuie sa fie clivat si inadit, iar moleculele de interferon produse de leucocite, fie ca nu sunt glicozilate, fie ca-si pastreaza activitatea biologica in absenta glicozilarii. Aceasta restrictie impusa de necesitatea prelucrarii ARNm, prin eliminarea intronilor, pentru alte proteine este depasita folosind ADNc.

In general, proteinele care se secreta sunt produse in cantitati mult mai mari decat acelea care se acumuleaza in celula bacteriana, unde tind sa sufere denaturare si digestie. Conditiile reducatoare din celula, impiedica formarea legaturilor S-S stabilizatoare pentru cele mai multe proteine extracelulare.

La E. coli s-au transferat genele pentru sinteza insulinei. Avantajele insulinei bateriene sunt mari, deoarece ea inlocuie insulina din pancreasul de porc sau bovine. Randamentul de extractie a insulinei pancreatice este de numai 2 000 UI/kg tesut, ceea ce explica criza de insulina pe plan mondial. In plus, insulina animala se deosebeste de cea umana, prin aminoacizii din pozitiile 8, 9, l0 si este, prin urmare, o substanta non-self. Dupa administrare indelungata, la persoanele cu reactivitate imunitara mare, se sintetizeaza anticorpi anti-insulina. Insulina administrata, este legata imediat in complexe reversibile antigen-anticorp, din care se elibereaza necontrolat, provocand socul hiperinsulinemic, cu hipoglicemie marcata. Insulina bacteriana, fiind codificata de gena sintetizata chimic, este identica din punct de vedere chimic cu cea umana. Randamentul de obtinere a insulinei prin metode biotehnologice este foarte mare: circa l00 000 molecule/celula bacteriana.

Somatostatina este hormonul hipotalamic reglator al cresterii, inhibitor al sintezei de STH hipofizar, izolat de R. Guillemin. Poate fi produsa de E. coli manipulata genetic, purtatoare a genei obtinuta prin sinteza chimica.

Hormonul de crestere (STH) produs de adenohipofiza, ridica probleme medicale deosebite, pentru ca are un grad inalt de specificitate a actiunii sale. Se utilizeaza in tratamentul nanismului, numai hormonul extras din lobul anterior al hipofizei umane, imediat dupa moarte. Acesta este un material foate greu de procurat, care in plus prezinta riscul infectiilor lente. Astazi, STH se obtine prin biosinteza in celulele de E. coli, purtatoare ale genei obtinuta prin sinteza chimica, cu secventa corespunzatoare celei umane.

Interferonul se obtine, in mod obisnuit, din leucocite, in centrele hematologice specializate. Este folosit pentru tratamentul unor forme de cancer, dar producerea sa este foarte costisitoare, pentru un bolnav fiind necesare circa un miliard de unitati. Biosinteza sa in celulele de E. coli clonate, purtatoare ale genei umane este mult mai ieftina. Sinteza moleculelor active de interferon este posibila numai daca in ADN plasmidial s-a inclus acea parte a genei care codifica aminoacizii sai, fara codonii care specifica traducerea peptidului semnal.

Culturile de celule animale sunt utilizate pentru producerea factorilor necesari tratamentului hemofiliei. Anterior, acesti factori erau izolati din sange, cu un mare risc de a transmite virusurile hepatitie B, C sau HIV.

Obtinerea unor proteine sanguine de coagulare prin tehnologia ADN recombinant face aceste substante mai usor disponibile pentru persoanele cu hemofilie sau alte dezordini sanguine.

Au fost sintetizate artificial si clonate in celulele de E. coli, genele ce codifica proteine reglatoare ale circulatiei sangelui (bradikinina, angiotensina), precum si gene ce codifica sinteza mediatorilor sinapselor neuronale (endorfine).

ADN recombinant este folosit pentru producerea vaccinurilor, mai ieftine si in cantitati mai mari. Clonarea genelor in celulele de levuri a facut posibila obtinerea antigenului HBs (antigen Australia), precum si a glicoproteinelor altor virusuri: HSV, VEB, HIV, RSV. Aceste vaccinuri, mai ieftine si mai specifice, produc mai putine efecte secundare.

Tehnologia ADN recombinant a fost utilizata pentru diagnosticul defectelor genetice fetale, prin metoda studiului enzimelor in celulele fetale din lichidul amniotic. Defectele sunt detectate, folosind ADN recombinant cu o secventa cunoscuta de nucleotide. Eroarea ADN fetal este echivalenta cu absenta enzimelor sau cu sinteza unor enzime nefunctionale. Este posibila insertia genei absente sau inlocuirea celei defecte (terapie genica).

Expertii pot determina paternitatea cu precizie de 99%, pe baza compararii probelor de ADN, iar "amprenta ADN" recoltata din lichidul spermatic, din sange sau din celulele firului de par, este folosita in medicina legala pentru identificarea faptasului.

In biotehnologie, procesele de fermentatie alcoolica, producerea antibioticelor si a altor substante pot fi ameliorate prin tehnicile de ADN recombinant. De exemplu, insertia genelor pentru sinteza amilazei la Saccharomyces ar face posibila obtinerea alcoolului din amidon. Etapa de zaharificare a amidonului pentru obtinerea berii nu ar mai fi necesara. Vinul ar putea fi obtinut din sucuri care contin amidon, in loc de glucide simple.

Degradarea celulozei si a ligninei, producerea unor substante combustibile, indepartarea poluantilor si biosolubilizarea ("lesierea") metalelor din minereurile sarace, sunt procese naturale, dar viteza desfasurarii lor, poate fi mult accelerata prin utilizarea unor bacterii manipulate genetic. Lesierea industriala sau extractia metalelor din minereurile sarace de cupru si uraniu, este deja facuta de bacterii din g. Thiobacillus.

Tulpinile de Pseudomonas putida, care degradeaza diferite componente din petrol pot fi manipulate astfel, incat o tulpina sa metabolizeze toate componentele petrolului si sa fie utilizata pentru depoluare.

In agricultura, tehnologia ADN recombinant este folosita in scopul controlului insectelor daunatoare. Genele toxinei de B. thuringiensis au fost transferate la Ps. fluorescens, iar acestea se aplica pe semintele de cereale. Astfel, toxina se prodce in jurul radacinilor plantei, avand efect protector fata de insecte.

Prin tehnologia ADN recombinant se incearca obtinerea unor soiuri de plante cu randament productiv superior, dar care sa fie rezistente la ierbicidele folosite pentru combaterea buruienilor.

Tehnologia ADN recombinant a stat la baza crearii bancilor de gene ale diferitelor organisme: om, Drosophyla, soarece, X. laevis, levuri, bacterii, virusuri. Fiecare banca este o colectie de molecule hibride de ADN, care cuprinde genele unei specii. Idealul este ca banca sa contina tot setul de gene ale unui organism.

Extinderea metodelor de inginerie genetica la nivelul celulei anuimale este legata de identificarea moleculelor vectoare. Acestea trebuie sa aiba calitatea nu numai de a lega materialul genetic strain, dar sa permita si replicarea acestuia.

Dezavantajele clonarii genelor animale si umane in celula bacteriana provin din urmatoarele aspecte:

cele mai multe clonari de gene s-au facut in celulele de E. coli K_l2. Ca orice bacterie Gram negativa, E. coli nu secreta usor produsele de sinteza, care astfel se acumuleaza in citoplasma si sunt partial denaturate;

celulele bacteriene nu produc modificari specifice, esentiale pentru activitatea biologica a produselor de sinteza: glicozilari, fosforilari, carboxilari;

unele molecule sintetizate de gene clonate in celula bacteriana sunt pliate anormal si dobandesc o configuratie spatiala modificata (de exemplu, Il-2), ceea ce le confera caracter nonself si dupa administrare induc sinteza anticorpilor. Activitatea lor biologica este modificata in raport cu a moleculei native.

Perspectivele utilizarii bacterilor reprogramate genetic. Pentru viitor se apreciaza ca multe substante chimice care in prezent se obtin prin sinteza, vor fi produse de catre microorganismele modificate genetic, deoarece foarte multe procedee de sinteza chimica industriala au ca punct de plecare petrolul si derivatii sai. O buna parte a industriei petrolului va evolua spre bioindustrie. In viitor, pe cale biotehnologica, se vor produce combustibili neconventionali: metanol, etanol, metan, H₂, petrol sintetic.

Microorganismele reprogramate genetic prin tehnologia ADN recombinant vor fi folosite pentru recuperarea metalelor neferoase din zacamintele sarace si din depozitele de steril, pentru extractia petrolului (70% ramane in zacamant), pentru combaterea poluarii cu petrol.