INFLUENTA FACTORILOR FIZICI ASUPRA MICROORGANISMELOR

Temperatura

Temperatura este unul din cei mai importanti factori de mediu care influenteaza cresterea si supravietuirea organismelor. Rata reactiilor chimice si enzimatice in celula creste odata cu cresterea temperaturii, dar acizii nucleici si alte componente celulare sunt sensibile la temperaturi crescute si pot fi inactivate ireversibil.

Temperatura de dezvoltare. Pentru fiecare specie de organism exista o temperatura minima, sub nivelul careia cresterea nu mai are loc, o temperatura optima, la care cresterea este cea mai rapida si o temperatura maxima, deasupra careia cresterea nu mai este posibila. Spectrul termic care permite desfasurarea normala a proceselor metabolice si deci cresterea si multiplicarea microorganismelor reprezinta zona temperaturii de dezvoltare. Temperatura optima de dezvoltare este mai apropiata de valoarea maxima, decat de cea minima. Cele trei puncte termice, denumite temperaturi cardinale sunt, in general, caracteristice pentru fiecare tip de organism, dar nu sunt fixe, deoarece pot fi modificate de alti factori, ca de exemplu, pH si concentratia nutrientilor. Temperatura de dezvoltare poate fi cuprinsa in limite restranse (35-40^o), la microorganismele stenoterme si in limite largi (6-50^o) la cele euriterme. In general, temperatura de dezvoltare este cuprinsa intre -5^o si 70-8o^o. Aceasta variatie corespunde temperaturii minime, optime si maxime. Organismele stenoterme traiesc in habitate cu temperatura relativ constanta, iar cele euriterme populeaza mediile in care temperatura variaza considerabil.

Temperatura minima de dezvoltare reprezinta valoarea termica cea mai scazuta la care microorganismele se mai multiplica inca in mod evident. La aceasta temperatura, rata metabolismului este scazuta, iar rata cresterii si diviziunii celulare este mult incetinita. Limita inferioara a temperaturii minime de dezvoltare este determinata, teoretic, de temperatura de inghetare a apei, dar se situeaza sub 0^o (-5^o), deoarece punctul de congelare a constituientilor celulari este mai scazut decat acela al apei pure.

In conditii particulare, care maresc zona de stabilitate fizica a apei celulare (continutul ei bogat in diferite substante si presiunea osmotica ridicata), temperatura minima tolerata de microorganisme poate sa scada pana la -l8^o. Aceasta explica procesul de multiplicare a unor specii specii bacteriene in apa marii, la temperaturi de -5-ll^o, iar mucegaiurile si unele bacterii (Pseudomonas) pot creste la -l8^o, in solutii concentrate de zahar. Cresterea si multiplicarea unei generatii bacteriene dureaza in aceste conditii, saptamani si chiar luni.

Chiar in materialele inghetate se gasesc pungi microscopice de apa lichida, unde microorganismele pot sa creasca.

Temperatura minima de dezvoltare a microorganismelor mezofile ar fi determinata de incetarea transportului substantelor dizolvate prin membrana celulara. Mecanismele biochimice ale inactivarii transportului membranar ar putea fi urmatoarele:

modificarea conformationala a moleculelor proteice;

modificarea arhitecturii membranei celulare;

limitarea producerii si utilizarii ATP.

Temperatura optima de dezvoltare este definita de nivelul termic la care dezvoltarea unei populatii de microorganisme ale unei specii are loc cu o rata maxima. Aceasta valoare nu coincide cu aceea a temperaturii optime pentru alte activitati fiziologice ale celulei. De aceea, numarul maxim de celule vii se acumuleaza nu atunci cand diviziunea are loc foarte rapid, ci in conditiile unui ritm mai lent de diviziune, probabil datorita diferentelor de temperatura optima necesara diferitelor activitati celulare. La o temperatura mai ridicata creste rata acumularii produselor de catabolism si implicit efectul lor toxic devine inhibitor pentru cresterea celulara. In mod similar, viteza de fermentatie sau de acumulare a unui anumit produs de metabolism este maxima la valori termice care nu coincid obligatoriu cu temperatura optima pentru diviziunea celulara. De aceea, nu se poate vorbi despre o temperatura optima pentru crestere si diferite activitati biologice, ci de temperatura optima pentru fiecare din activitati, luate in parte.

Temperatura maxima de dezvoltare reprezinta valoarea cea mai ridicata la care activitatea biologica a unui anumit organism este inca posibila, iar multiplicarea sa se mai poate face in mod evident. Aceasta valoare, limitata de termolabilitatea proteinelor si acizilor nucleici este de obicei cu l0-l5^o mai mare decat temperatura optima pentru microorganismul respectiv.

In functie de temperatura lor de dezvoltare, microorganismele pot fi grupate in trei categorii:

a) Microorganismele criofile sau psichrofile cresc cel mai bine la temperaturi scazute. Ele traiesc in izvoarele reci, in lacuri si mari, in regiunile de altitudine si polare. Aceste microorganisme prezinta un mare interes economic, deoarece pot altera produsele alimentare conservate prin congelare.

b) Microorganismele mezofile se dezvolta la temperaturi medii (lo-45^o). Ele fac parte din microbiota normala a animalelor homeoterme, fata de care se comporta ca saprobionte. Din aceiasi categorie fac parte microorganismele parazite.

c) Microorganismele termofile se dezvolta in apele termale si in platformele de deseuri menajere si din zootehnie.

d) Microorganismele hipertermofile

a) Microorganisme criofile

Organismele care cresc la temperaturi scazute se numesc criofile sau psichrofile. Apartenenta unui microorganism la aceasta categorie este conditionata de capacitatea lui de a creste la 0^o.

Se disting doua categorii de organisme psichrofile: obligate si facultative.

Organismele obligat-criofile se dezvolta la o temperatura optima de cel mult l5^o, iar temperatura maxima, este de circa 2o^o.

Microorganismele criofile facultative, desi pot creste la 0 ^oC, cresc cu o rata optima la 25-30^o, iar temperatura maxima de crestere este de 35-40 ^oC. Criofilele obligate sunt stenoterme, iar cele facultative sunt euriterme. Psichrofilele obligate traiesc in medii cu temperatura constant scazuta. La temperatura de 25-30 ^oC ele mor rapid, ceea ce ingreuneaza studiul. Organismele psichrofile sunt un grup divers: bacterii, fungi, alge. Cele mai studiate psichrofile obligate sunt algele eucariote, ce formeaza mase dense in interiorul si sub gheata regiunilor polare. Algele psichrofile se gasesc adeseori, pe suprafata zapezii si ghetii, in numar atat de mare, incat determina culoarea rosie sau verde a suprafetei. Cea mai comuna alga care creste pe zapada este Chlamidomonas nivalis. Celula vegetativa este pigmentata verde. Odata cu topirea zapezii, are loc sporularea. Sporii au culoarea rosie.

Organismele psichrofile facultative se gasesc in solul si apele din regiunile cu climat temperat. Temperatura optima de crestere este de 25-30 ^oC, iar cea maxima, de 35 ^oC. Deoarece mediile din regiunile temperate se incalzesc in sezonul cald, ele nu sunt favorabile cresterii organismelor psichrofile obligate.

Microorganismele psichrofile facultative sunt implicate in alterarea calitatii produselor alimentare de origine animala si vegetala, conservate prin racire sau inghetare. Cu cat temperatura de conservare este mai scazuta, cu atat multiplicarea microorganismelor este mai lenta sau chiar imposibila.

Cresterea la temperaturi scazute a microorganismelor psichrofile este explicata prin proprietatile enzimelor lor, capabile sa catalizeze mai eficient la temperaturi scazute. Probabil, din aceasta cauza, psichrofilele sunt foarte sensibile la temperaturi mai mari, fiind inactivate rapid la 30-40 ^oC.

Procesele de transport activ functioneaza optim la temperaturi scazute, iar continutul membranei celulare in acizi grasi nesaturati este mai crescut decat la alte organisme. Consecinta este ca la temperaturi scazute, membrana ramane semifluida. Membranele cu continut ridicat de acizi grasi saturati sunt mai rigide si la temperaturi scazute devin nefunctionale.

Inghetarea. Temperatura de inghetare a diferitelor medii este dependenta de compozitia si concentratia substantelor dizolvate. Inghetarea opreste cresterea microorganismelor, dar moartea celulara nu survine totdeauna. Celulele mari sunt mai sensibile la inghetare, iar cele cu perete celular gros sunt mai rezistente. Inghetarea este una din cele mai bune metode de conservare a culturilor de microorganisme.

Prin inghetare, unele celule sunt omorate, dar daca supravietuiesc, ele raman viabile pentru perioade lungi de timp. Procesele vitale sunt suspendate (functiile celulare sunt oprite) si sunt reluate dupa restabilirea regimului termic. Leziunile celulare ce rezulta din inghetarea apei intracelulare sunt consecinta efectului fizic al cristalelor de gheata, in special asupra membranei celulare. Inghetarea rapida produce cristale mici si leziunile pot fi minime. De aceea, inghetarea trebuie facuta rapid. Astfel, levurile raman viabile intr-o proportie optima, daca racirea se face cu l0^o/minut, iar pentru hematii, racirea cu 20^o/minut ofera cea mai buna protectie. Severitatea efectelor deshidratarii este limitata de glicerol si dimetilsulfoxid, adaugate in proportie de 0,5M la mediul de suspensie. Ele sunt miscibile cu apa si penetreaza in celula.

Moleculele mari (albumina serica, dextranul, polivinil-pirolidona) la concentratia de l0^-5- l0^-3 M nu penetreaza in celule. Efectul lor protector se realizeaza prin combinarea cu molecule ale suprafetei celulei si astfel este prevenita lezarea membranei celulare.

Rezistenta celulelor la inghetare este folosita pentru conservarea lor intr-un mediu adecvat. Cu cat temperatura este mai scazuta, cu atat conditiile de pastrare sunt mai bune. Temperatura de -70^o este mai buna decat cea obisnuita de -20^o, iar temperatura de -l95^o a azotului lichid este cea mai buna.

b) Microorganisme mezofile

Microorganismele mezofile au temperatura optima de dezvoltare, cuprinsa intre 25 si 40^o. Cele care au temperatura de crestere mai mare de 30^o se dezvolta in cavitatile macroorganismelor homeoterme, ca saprobionte sau parazite. De exemplu, E. coli se dezvolta optim la temperatura de 39^o. Bacteriile mezofile asociate organismelor homeoterme sunt relativ stenoterme. Aceasta proprietate este evidenta la microorganismele patogene.

Microorganismele mezofile cresc cu o rata scazuta la o temperatura mai mica de 20^o. Sub l0^o, cresterea lor este oprita, deoarece se blocheaza initierea sintezei proteice, dar sinteza celor deja initiate nu este afectata. La o temperatura scazuta este inhibata si functia enzimelor. Inhibitorul este probabil, un metabolit obisnuit, care la temperatura scazuta se leaga foarte strans de enzima. Odata cu cresterea temperaturii, inhibitorul se disociaza si enzima isi reia functia.

Acest mecanism de actiune este sprijinit de existenta a doua categorii de mutante: mutantele sensibile la rece si cele rezistente la rece. Mutantele sensibile la rece nu cresc la l5^o (la care tulpina salbatica creste), deoarece enzima mutanta leaga inhibitorul feed-back mai ferm decat enzima de tip salbatic. Mutanta rezistenta la rece produce o enzima mai putin sesibila la inhibitia prin feed-back, decat tipul salbatic.

La E. coli s-au izolat mutante termo-sensibile, care nu cresc la temperatura la care creste tulpina salbatica. Aceste mutante produc o proteina mai sensibila la denaturarea termica, decat proteina omologa de tip salbatic.

Desi s-au izolat mutante cu limite termice superioare sau inferioare fata de tipul salbatic, temperatura lor optima de dezvoltare ramane aceiasi, deoarece este conditionata de un numar mare de proteine.

S-a studiat raspunsul microorganismelor mezofile la socul hipo- sau hipertermic. Expunerea microorganismelor mezofile la temperaturi mai inalte determina reactia de raspuns la socul termic. Raspunsul la socul termic consta intr-o crestere rapida si trecatoare a ratei de sinteza a unor proteine din categoria chaperonilor, care au rolul de repliere a proteinelor denaturate, denumite proteine de soc termic. Ele au rolul de a proteja celula de caldura si de alte conditii de stress. Cresterea ratei sintezei lor este rapida - in decurs de ordinul secundelor - dupa expunerea culturii bacteriene la o temperatura superioara.

Trecerea culturii de E. coli, de la 37^o la 46^o induce o crestere de l00 de ori a ratei sintezei proteinelor de soc termic, insa rata globala a sintezei proteinelor scade. Proteinele de soc termic sunt factori de rezistenta fata de temperaturile letale. Ele fac parte din categoria chaperonilor. Chaperonii sunt proteine constitutive normale, a caror rata de sinteza creste brusc dupa socul termic.

Raspunsul la socul termic s-a evidentiat nu numai la bacteriile mezofile, ci si la cele termofile, la cele psichrofile si la Archaea.

Invers, prin scaderea temperaturii la l0^o, unele bacterii sintetizeaza un set de circa l4 proteine, denumite proteine de soc la rece, desi rata globala a sintezei proteinelor scade. Unele proteine de soc la rece au rolul de a stabiliza capacitatea de transcriere a ADN si de traducere a mesajului in proteine.

Stressul infometarii determina un raspuns ce consta in sinteza a 30-50 de proteine cu rol adaptativ. Infometarea celulelor bacteriene are ca rezultat cresterea rezistentei lor la diferite stressuri, inclusiv la temperaturi scazute.

Reactivitatea celulei la diferite stressuri este codificata de genele de stress. Ele codifica factori activatori ai setului de gene ce codifiaa sinteza proteinelor de adaptare la stress.

c) Microorganisme termofile

Microorganismele termofile cresc la temperaturi mai mari de 45-50^o si au o raspandire limitata in mediile naturale. Solul expus luminii solare se incalzeste la temperaturi mai mari de 50^o, iar solurile de culoare inchisa se incalzesc la 70^o. Materialele care fermenteaza (deseuri menajere, materiale vegetale) ating temperaturi de circa 70^o. Cele mai ridicate temperaturi in natura sunt asociate cu fenomenele vulcanice. Adeseori, izvoarele termale ating temperatura de fierbere. Pe masura ce apa se indeparteaza de sursa, se realizeaza un gradient termic, cu o distributie a speciilor de microorganisme, dependenta de nivelul termic.

Organismele procariote sunt capabile sa creasca la temperaturi mai mari, comparativ cu organismele eucariote. Cele nefotosintetizante tolereaza temperaturi superioare, in raport cu cele fotosintetizante.

In interiorul grupului microorganismelor termofile sunt diferente ale temperaturii optime de dezvoltare: speciile termofile cresc optim intre 50 si 80^o, iar cele hipertermofile cresc optim la temperaturi intre 80-110^o.

Mecanismul biochimic al tolerantei la temperaturi crescute nu este bine cunoscut. Enzimele microorganismelor termofile contin lipide membranare bogate in acizi grasi saturati, care permit membranelor sa ramana stabile si functionale la temperaturi ridicate. Acizii grasi saturati formeaza legaturi hidrofobe mai puternice decat acizii grasi nesaturati, ceea ce explica stabilitatea membranei.

Absenta microorganismelor eucariote la temperaturi mai mari de 60^o se poate datora termolabilitatii inerente a membranelor, in special a membranei nucleare, mitocondriale sau cloroplastice. Membranele mitocondriale sunt deosebit de sensibile la caldura. Prin incalzirea celulelor cu cateva grade peste temperatura maxima, mitocondriile dispar. Membranele organitelor celulei eucariote sunt suficient de fluide pentru a permite trecerea macromoleculelor. Membrana nucleara este permeabila pentru ARNm si pentru subunitatile ribosomale, care trec in citoplasma. La temperaturi crescute, membrana nucleara isi pierde functionalitatea.

d) Microorganismele hipertermofile

Bacteriile hipertermofile se dezvolta foarte bine la temperaturi cuprinse intre 80-ll0^o. Nu cresc la temperaturi mai mici de 60-80^o. Ele se gasesc in regiunile hidrotermale submarine anaerobe, bogate in H₂S, H₂, S^o si SO₃^2- si cu o concentratie salina caracteristica apei marine, precum si in emanatiile de gaze fierbinti din cratere vulcanice ce contin vapori de apa, CO₂ si H₂S. In 1999 erau descrise peste 70 de specii care cresc optim la 110^o si mai mult. Putine sunt eubacterii(Thermotogales si Aquificales), restul fiind Archaea: Sulfolobales, Pyrococcales, Thermococcales.

Comunitatile hipertermofile sunt producatori primari si descompunatori ai materiei organice. Producatorii primari hipertermofili sunt organisme chimiolitotrofe:

cele aerobe oxideaza S^o cu O₂ si produc acid sulfuric (hipertermofile acidofile -Sulfolobales);

cele anaerobe reduc S^o cu H₂ si produc H₂S.

Continutul in materie organica al mediului submarin este foarte mic. Cele heterotrofe isi obtin energia din peptidele derivate prin descompunerea producatorilor primari.

Mecanismul molecular al hipertermofiliei nu este cunoscut. Deoarece proteinele si acizii nucleici sunt inactivate la temperaturi de 60-70^o se considera ca hipertermofilia s-ar datora existentei unor factori termostabilizatori (necunoscuti), prezentei unor enzime cu structura globulara particulara, existentei unor proteine de tip histonic cu rol termoprotector, precum si configuratiei mai stranse a dublei helice a ADN, care ar ingreuna separarea catenelor componente.

Enzimele izolate de la hipertermofile au activitate optima, de obicei intre 70-125^o, uneori net superioara temperaturii optime de crestere a organismului si de obicei sunt foarte stabile. Termostabilitatea este multifactoriala:

a)      enzimele ar fi mai rigide decat omologele lor mezofile. Rigiditatea excesiva ar putea explica inactivitatea lor la temperatura de 20-37^o. Unele enzime sunt active chiar la 37^o. Explicatia este ca enzimele hipertermofile combina flexibilitatea locala a situsului activ cu rigiditatea globala a moleculei.

b)      La temperaturi crescute proteinele se denatureaza prin depliere, datorita ruperii interactiunilor necovalente (legaturi de H, ionice, hidrofobe si interactiuni Van der Waals). Starea pliata a moleculei este rezultatul efectului hidrofob. Efectul hidrofob este forta majora a stabilitatii proteinelor. Interactiunile hidrofobe care confera structura secundara sunt asemanatoare cu ale enzimelor mezofile omologe, dar proteinele hipertermofile au interactiuni stabilizatoare suplimentare.

c)      Buclele rezultate prin pliere si capetele C si N ale moleculei sunt regiunile cu cei mai inalti factori termici (regiuni calde) si sunt cele mai sensibile la denaturarea termica. La hipertermofile, buclele sunt fie mai scurte, fie sunt mai bine ancorate de restul moleculei.

d)      Metalele (Co, Mg, Mn, Ca) stabilizeaza enzimele. Dificultatea cu care ele se indeparteaza din molecula de enzima este dovada indirecta a rolului metalelor in stabilizarea acestor molecule. Alfa-amilazele leaga specific Ca. Unele enzime termofile si hipertermofile contin atomi de metal, care lipsesc la mezofile. Feredoxina de Sulfolobus contine Zn.

e)      Sarurile anorganice stabilizeaza proteinele.Foarte putine proteine hipertermofile sunt glicozilate.

f)        Temperatura maxima de crestere a acestor microorganisme ar depasi putin ll3^o, la care biomoleculele termosensibile ar putea fi sintetizate cu o rata suficient de mare pentru a inlocui pe cele denaturate termic.

Organismele termofile si hipertermofile

Organismele termofile sunt acelea care necesita pentru crestere, o temperatura optima cuprinsa intre 50- 80⁰, iar cele HT cresc cu o rata optima la 80-110⁰.

Organismele HT (70 de specii la sfarsitul lui '99) s-au izolat din sulfurete continentale, straturi profunde geotermale care contin petrol, sedimente marine de mica si de mare adancime, izvoare hidrotermale la 4000 m adancime, precum si din medii industriale (apa de racire a uzinelor termice, instalatiile de incalzire a apei, instalatiile de epurare a apelor uzate), la temperaturi de 80-115⁰.

Cel mai termofil este Pyrolobus fumarii (113⁰). Probabil ca peste 113⁰, viata nu este posibila.

Thermus aquaticus s-a izolat din instalatiile de incalzire a apei(Brock, 75⁰).

HT traiesc in medii cu continut inalt de S si sunt chimiolitotrofe facultative sau obligate :

reduc S^o cu H₂ --- H₂S (anaerobe);

oxideaza S^o cu O₂ --- H₂SO₄ (aerobe).

Peste 110⁰, moleculele (aminoacizi, metaboliti) devin foarte instabile. ATP se hidrolizeaza spontan in solutie apoasa la 140⁰, iar interactiunile hidrofobe slabesc semnificativ.

Macromoleculele procariotelor termofile prezinta cateva adaptari :

enzimele, dar si alte proteine sunt mai stabile decat ale organismelor mezofile. Substitutia unui aminoacid intr-una sau in cateva pozitii esentiale ale unei enzime, permite o pliere compatibila cu stabilitatea termica;

un continut mai mare de Ala, participant la formarea helixului;

contin o proportie mai mare de resturi hidrofobe si aromatice (decat cele mezofile);

puntile S-S stabilizeaza proteinele, mai ales prin efectul antientropic^*, scazand entropia fata de valoarea entropiei proteinei depliate. Efectul antientropic al puntilor S-S creste proportional cu numarul de resturi de aminoacizi care se gasesc in interiorul puntii S-S;

Conform celui de-al II-lea principiu al termodinamicii (ramura a fizicii care studiaza energia si transformarile ei), toate procesele fizice si chimice sunt insotite de cresterea dezordinii sau intamplarii, adica a entropiei.

cresterea numarului de legaturi ionice intre cationi si sarcinile negative ale unor aminoacizi ;

cresterea proportiei acizilor grasi saturati in lipidele membranare, permitandu-le sa ramana stabile si functionale la temperaturi crescute. Acizii grasi saturati formeaza un mediu hidrofob mai puternic decat cei nesaturati si favorizeaza stabilitatea membranei;

hipertermofilele (majoritatea sunt Archaea) nu contin acizi grasi in membrana, dar au catene lungi de C si H (C₄₀), alcatuite din unitati repetitive de phytan cu 5 atomi de C, legate prin legatura eterica cu glicerol-fosfatul. Structura acestor membrane este un monostrat lipidic, mult mai stabila decat dublul strat lipidic al Eubacteria si Eucarya.

Enzimele HT au stabilitate intrinseca. Unele isi dobandesc termostabilitatea de la factorii intracelulari: saruri, concentratia proteica inalta, coenzime, substraturi, poliamine. Sarurile anorganice stabilizeaza proteinele pe doua cai: prin efectul specific (un ion metalic interactioneaza cu o proteina intr-o maniera conformationala; prin efectul general de sare, care modifica activitatea apei. K⁺ si NH₄⁺ sunt stabilizatori eficienti).

Organismele HT din marile adancuri suporta presiuni de 200-360 atm. Unele sunt barotolerante, altele sunt chiar barofile.

Absenta eucariotelor la temperaturi de peste 60⁰ se datoreaza instabilitatii membranelor organitelor, care trebuie sa ramana destul de permeabile pentru a permite trecerea moleculelor mari (ATP, ARN).

Mecanismele inactivarii proteinelor

Proteinele sunt mentinute in stare nativa (functionala) prin echilibrul fortelor necovalente: legaturi de H, forte ionice, interactiuni hidrofobe, van der Waals. Odata cu cresterea temperaturii, interactiunile necovalente se rup si proteinele se depliaza. Deplierea proteinelor se detecteaza prin diferite tehnici; calorimetrie diferentiala, fluorescenta, spectroscopia cu dicroism circular, evaluarea vascozitatii, tipul de migrare in campul electric.

Cisteinele sunt aminoacizii cei mai reactivi ai proteinelor. Autooxidarea, catalizata de cationi metalici (Cu²⁺), duce la formarea puntilor S-S intra- si intermoleculare sau la formarea acidului sulfenic.

Mecanismele termostabilizarii proteinelor

Efectul hidrofob este considerat a fi forta majora a plierii proteinelor si implicit, a stabilitatii lor. Hidrofobia induce proteinei o structura colapsata, definitorie pentru structura nativa, mentinuta prin fortele necovalente.

Proteinele termofile au urmatoarele caracteristici :

perechile de ioni (prezente in numar mic in moleculele proteice) nu reprezinta o forta pentru pliere, dar interactiunile electrostatice constituie o forta importanta de stabilizare a proteinei pliate. Perechile de ioni sunt mai puternice in molecula proteica decat in solventi pentru ca se formeaza intre sarcini fixe. Buclele si capetele N si C, de regula, au cei mai inalti factori termici, intr-o structura proteica cristalina. Buclele proteinelor hipertermofile au trasaturi structurale care pot stabiliza proteinele. Buclele sunt fie scurtate, fie mai bine ancorate de restul proteinei;

metalele stabilizeaza enzimele: unele enzime termofile si HT contin ioni metalici (Co²⁺, Mg²⁺, Mn²⁺), cu rol catalitic si structural, care nu se gasesc la omologele mezofile;

modificarea posttraducere prin glicozilare. Putine proteine HT sunt glicozilate. Glicozilarea poate cauza stabilizarea termica si poate preveni agregarea proteinelor partial pliate sau nepliate.

Sterilizarea

Temperaturile supramaximale moderate isi datoreaza efectul letal, procesului de intoxicatie metabolica, deoarece ridicarea temperaturii accelereaza reactiile metabolice.

Temperaturile supramaximale omoara majoritatea microorganismelor, prin efectul lor denaturant asupra proteinelor celulare si in special asupra enzimelor. Concomitent se produce topirea membranelor lipidice.

Efectul letal al temperaturilor supramaximale are o aplicatie practica majora: sterilizarea.

Cresterea temperaturii peste un nivel maxim produce efecte letale. Moartea celulelor prin incalzire se produce dupa o curba exponentiala si este mai rapida la temperatura crescuta. De aceea, pentru distrugerea prin sterilizare a unei populatii celulare, la temperaturi inferioare este necesar un interval de timp mai mare. Pentru sterilizarea unui material se alege temperatura si, in functie de nivelul termic, procesul are o durata corespunzatoare.

Tratamentul termic nu are efect cumulativ asupra celulei. Durata de timp in care celula a fost expusa la caldura, inainte de a muri nu are efect perceptibil. La organismele pluricelulare, tratamentul termic pare sa aiba efect cumulativ.

Se considera ca moartea microorganismelor sub actiunea caldurii este un eveniment de ordinul 1 (adica lipseste efectul cumulativ al actiunii factorului termic) si este rezultatul inactivarii unei singure entitati moleculare critice.

Moartea termica a celulei procariote se datoreaza efectului asupra membranei. La temperatura crescuta, lipidele membranare se dizolva si discontinuitatile de dimensiuni critice determina pierderea constituientilor celulari si moartea.

Rezistenta microorganismelor la caldura este diferita. Cele psichrofile sunt mai sensibile, iar cele termofile au cea mai mare rezistenta.

Natura mediului in care se face incalzirea influenteaza rezistenta celulelor vegetative si a sporilor. Moartea survine mai rapid la pH acid si de aceea alimentele acide sunt mai usor de sterilizat, comparativ cu cele neutre. Concentratiile mari de glucide, proteine si lipide maresc rezistenta organismelor la actiunea caldurii. In mediu uscat, celulele sunt mai rezistente decat in mediul umed. De aceea, sterilizarea termica a obiectelor uscate necesita temperaturi mai inalte si intervale de timp mai lungi decat sterilizarea umeda.

Endosporul bacterian are o termorezistenta net superioara, comparativ cu a celulelor vegetative, conferita de trei factori: termorezistenta proteinelor, deshidratarea si mineralizarea.

Factorul major al rezistentei termice este cantitatea si starea fizica a apei (apa lagata) din endospor. In timpul sporularii, protoplasma se reduce la un volum minim. Se acumuleaza cantitati mari de Ca²⁺ si de acid dipicolinic (prezent numai in spor). Citoplasma dobandeste o stare de gel. Cortexul sporal gros conditioneaza indirect rezistenta termica, deoarece impiedica imbibarea sporului cu apa, dar sporii fara cortex sunt la fel de rezistenti ca si sporii obisnuiti. Proteinele sporale pot avea o rezistenta intrinseca la caldura sau termostabilitatea le este conferita de asocierea cu dipicolinatul de Ca²⁺. In celula sporala se gasesc proteine specifice, de dimensiuni mici, acidosolubile, asociate cu ADN, dar si proteine neasociate cu macromoleculele sporului.

Principiile sterilizarii termice si dezinfectiei

Principiile sterilizarii se ilustreaza cel mai bine, utilizand caldura ca agent de actiune, ale carei efecte sunt bine cunoscute.

Rata mortii bacteriilor care contamineaza un material este logaritmica, dar mult accelerata.

Principiul 1: o proportie definita din totalul celulelor mor intr-un interval de timp dat. Daca la o temperatura data, in primul minut mor 30% din totalul celulelor, in cel de al II-lea minut mor 30% din rest s.a.m.d.

Cand numarul celulelor bacteriene dintr-o proba supusa sterilizarii, ramane foarte mic, de exemplu l00, dupa primul minut raman 70 viabile, dupa al II-lea raman 49, dupa al III-lea 34, iar dupa l2 minute - o celula. Probabilitatea de a gasi un singur organism viu ramane foarte mica. O proba este sterila, atunci cand probabilitatea de a gasi un organism viu nu depaseste l/l000.

Principiul 2: cu cat o proba contine mai putine microorganisme, cu atat timpul necesar sterilizarii este mai scurt. Curatirea cat mai avansata a obiectelor, inainte de a le steriliza este o aplicatie practica a acestui principiu. Materia organica diminua eficienta multor agenti chimici.

O specie bacteriana are o sensibilitate diferita la actiunea unui agent, in functie de faza de crestere. Cea mai sensibila faza, pentru cele mai multe microorganisme este cea de crestere logaritmica, deoarece in aceasta faza sunt active toate reactiile de biosinteza si interferenta cu o singura enzima poate sa omoare celula. Sporii sunt foarte rezistenti.

Principiul 3: microorganismele difera in privinta sensibilitatii lor la actiunea agentilor antimicrobieni.