Mecanismele moleculare ale efectului citopatic

Mecanismele moleculare ale efectului citopatic

ECP este consecinta parazitismului absolut al virusurilor, a eficientei lor de a subordona activitatea metabolica a celulei si de a o orienta in sensul sintezei macromoleculelor cu specificitate virala. Bazele moleculare ale ECP sunt putin cunoscute.

Virusurile inhiba mai multe procese celulare pentru ca un singur mecanism de actiune nu are eficienta completa. Mecanismele ECP sunt specifice virusului infectant.

Intr-un complex virus-celula, predomina unul dintre mecanismele prezentate mai jos.

Modificari metabolice

Interactiunea citolitica produce inhibitia sintezei macromoleculelor specifice celulei, denumita si "efect de intrerupere". In absenta sintezelor specifice, care sa inlocuiasca moleculele uzate, apar modificari functionale si structurale incompatibile cu viata.

Virusurile controleaza metabolismul celular prin mai multe mecanisme, care constau in:

schimbari in metabolismul intermediar, in special al dezoxiribonucleotidelor ;

modificari ale sintezei, prelucrarii, transportului si turnover-ului macromoleculelor celulare ;

intensificarea exprimarii genelor virale si interferenta cu programul celular.

De regula, virusul nu omoara celula inainte de desfasurarea ciclului de replicare.

Modificari ale metabolismului ADN celular. Replicarea ADN celular are loc in faza S a ciclului si necesita dezoxiribonucleotide, enzime de replicare si sinteza proteica.

Pentru replicarea ARN al ribovirusurilor este folosita rezerva de ribonucleotide a celulei si metabolismul ADN celular nu se modifica semnificativ. Retravirusurile se integreaza in cromosomii celulei si stimuleaza rata diviziunii celulare, dar nu interfera cu replicarea ADN celular.

Replicarea ADN viral este, de cele mai multe ori, dependenta de disponibilitatea dezoxiribonucleotidelor celulare.

Dezoxiribovirusurile se multiplica in diferite tipuri de celule, chiar in cele diferentiate terminal (de exemplu, neuroni), in care sinteza ADN si diviziunea inceteaza. Ele poseda mecanisme prin care depasesc conditiile restrictive ale cantitatii limitate de dezoxiribonucleotid-trifosfati (dNTP).

Uneori, chiar celulele care se divid nu pot oferi cantitatile de dNTP impuse de sinteza ADN viral, ceea ce necesita un aport suplimentar.

Disponibilitatea limitata a dNTP este depasita prin doua mecanisme :

virusurile cu genom mic (papova) induc intrarea celulei in faza S. Se exprima genele celulare pentru sinteza enzimelor ce catalizeaza sinteza dNTP si replicarea ADN. Antigenul T de 94 kDa, codificat de SV_4o se leaga de o proteina supresoare a diviziunii celulare si a replicarii ADN - proteina p53 - si astfel se anuleaza efectul sau inhibitor. Exprimarea unei singure gene virale pregateste celula pentru replicarea ADN. Activarea genelor reglatoare ale diviziunii, sta la baza potentialului oncogen al acestor virusuri;

virusurile cu genom mare (adeno, herpes, pox), suplimenteaza cantitatea de dNTP deoarece codifica propriile enzime ale metabolismului nucleotidelor si ale replicarii ADN. Genele virale pentru aceste enzime au fost probabil dobandite din celula. Ele nu functioneaza, daca virusul infecteaza celule metabolic active, dar confera independenta replicarii virale de faza S a ciclului celular. Enzimele virale catalizeaza aceleasi reactii ca si omologele lor celulare, dar specificitatea de substrat si mecanismele de reglare sunt diferite, ceea ce le face tinte pentru agentii antivirali. De exemplu, acyclovir si gancyclovir, analogi ai guanozinei pot fi fosforilate de Tk a herpesvirusului, dar nu de Tk a celulei.

adenovirusurile codifica trei proteine pentru replicarea ADN: o ADN-polimeraza, o

proteina legata terminal de genom cu rol de primer al sintezei ADN viral si o proteina

care se asociaza cu ADN monocatenar. Herpesvirusurile codifica 7 proteine cu rol in

replicarea ADN, ceea ce le confera independenta de ciclul celular si le permite sa se

multiplice dupa inhibitia sintezei ADN si chiar in celule care nu se divid (neuroni), unde

produc infectii persistente latente .

Modificarea starii fizice a ADN. Virusurile complexe(adeno, herpes)modifica starea fizica a ADN celular, facand-o incompatibila cu replicarea si cu functia de transcriere, ceea ce determina inhibitia sintezei macromoleculelor specifice celulei. Matricea nucleara este substratul fizic pentru cromatina, dar si pentru procesele de transcriere si replicare a ADN.

Unele molecule virale se asociaza cu matricea nucleara si modifica distributia ADN in nucleu. De exemplu, in celulele infectate cu virusuri herpetice, ADN se desprinde din punctele de insertie pe matricea nucleara, iar dupa infectia cu adenovirusuri, efectul este invers, de marginatie a cromatinei (deplasarea si aglomerarea ei spre periferia nucleului, in blocuri heterocromatice). Virusurile pox codifica o DN-aza, ce patrunde in nucleul celulei si depolimerizeaza ADN monocatenar, despiralizat pentru replicare sau pentru transcriere.

Ca raspuns la infectia cu unele virusuri, celulele sufera fenomenul de apoptoza, in cursul careia se produce clivajul internucleosomal al cromatinei. In general, virusurile inhiba programul apoptotic, celula ramanand viabila ca substrat al multiplicarii virale, iar altele (influenza, Sindbis) par a fi adaptate sa se multiplice in celulele apoptotice.

Modificari ale metabolismului ARN. Pentru sinteza proteinelor virale, este totdeauna necesara sinteza ARNm cu specificitate virala. Perturbarea metabolismului celular se produce la toate treptele: transcriere, prelucrare, transportul nucleo-citoplasmatic, traducere, sau modificarea ratei degradarii. Toate confera ARN viral un avantaj competitiv prin urmatoarele mecanisme:

toate ribovirusurile si poxvirusurile codifica sinteza unei ARN-polimeraze cu actiune specifica fata de genomul viral;

dezoxiribovirusurile codifica in faza timpurie, sinteza cel putin a unui factor viral care schimba specificitatea ARN-pol II celulare si o orienteaza spre ADN viral, trecand-o sub controlul unui promotor viral foarte activ.

majoritatea ribovirusurilor inhiba activitatea aparatului de transcriere al celulei, deoarece se multiplica in citoplasma si nu necesita activitatea de transcriere a celulei. Unele proteine virale cu rol important in ciclul de multiplicare (de exemplu proteaza 3C a poliovirusului si proteina M a VSV), inhiba transcrierea genelor gazdei (Lyles, 2000, mmbr, 64, 4) catalizata de toate cele 3 ARN-polimeraze celulare. Proteinele ribovirusurilor sunt localizate, in cea mai mare parte in citoplasma, dar proteaza 3C si proteina M se gasesc si in nucleul celulei infectate. In cele 2 sedii proteina M indeplineste functii distincte: in ciclul replicarii virale(are rol in asamblarea virionilor si inducerea procesului de inmugurire), iar in nucleu inhiba transcrierea genelor celulare. Proteaza 3C a FMDV cliveaza histona H₃ si inhiba transcrierea prin alterarea matritei cromatiniene. Exceptia o constituie virusurile influenza care avand o faza nucleara a ciclului, necesita activitatea de transcriere a celulei pentru producerea oligonucleotidelor bonetate pe care le folosesc ca primeri pentru sinteza ARNm viral. ;

cele mai multe virusuri neoncogene inhiba maturarea ARNm celular prin mecanisme complexe. De exemplu, proteina NS₁ a virusului gripal inhiba maturarea ARNm celular, in 2 trepte: interfera cu treapta de clivare a ARN premesager si inhiba treapta adenilarii capatului 3'. Tot ea cliveaza un fragment de l0-l3 nucleotide de la capatul 5' al ARNm celular. Fragmentele au rol de primeri pentru initierea sintezei ARNm viral in nucleul celulei infectate, data fiind incapacitatea ARN-polimerazei virale de a initia sinteza moleculelor de ARN. Efectul este transferul secventei de bonetare de la ARNm celular la mesagerii virali, facandu-i nefunctionali pe primii si asigurand traducerea celor virali;

la adenovirusuri, doua proteine timpurii inhiba transferul nucleo-citoplasmatic al ARNm celular din nucleu si favorizeaza transferul ARNm viral tardiv;

virusurile herpetice si virusul vaccinal maresc rata degradarii ARNm si inhiba sinteza proteinelor celulare. Cresterea ratei degradarii nu este specifica ARNm celular, deoarece ARNm virali sunt supusi aceluiasi proces, dar abundenta ARNm virali datorata ratei superioare a transcrierii compenseaza pierderea prin degradare. In celulele infectate cu VSV, ARNm virali, in mare exces cantitativ, sunt asociati cu proteina N (nucleoproteina) in complexe RNPm si formeaza o rezerva mare de ARNm care intra in competitie eficienta cu ARNm al gazdei. Dar ARNm viral este tradus preferential chiar cand abundenta sa este diminuata de 10 ori sau mai mult: se crede ca ARNm viral contine secvente ce favorizeaza traducerea (situsuri interne care favorizeaza legarea ribosomilor);

- in celulele infectate cu virusul influenza este inactivat un factor celular(eIF4E) care se leaga de secventa de bonetare a ARNm. Pentru a se lega de capatul bonetat, eIF4E trebuie fosforilat de o kinaza celulara. In celulele infectate cu virusul influenza, eIF4E este partial inactivat prin nivelul redus al fosforilarii. ARNm virali au acelasi cap bonetat si o secventa de 10-13 nucleotide, ca si mesagerii celulari si teoretic, ar trebui sa fie la fel de sensibili la inactivarea eIF4E. ARNm al virusului influenza contine o secventa la capatul 5' care favorizeaza legarea ribosomilor si ridica nivelul traducerii.

Modificari ale metabolismului proteinelor. Sinteza, prelucrarea si transportul proteinelor virale constituie domeniul de intersectie a functiilor celulare si virale, deoarece virusurile intra in competitie cu mecanismele sintezei proteinelor celulare. ARNm virali si celulari intra in competitie directa pentru traducere. Atat celula cat si virusul sunt dependente de aparatul celular de sinteza si transport proteic.

Inhibitia sintezei proteinelor celulare este una dintre consecintele cele mai evidente ale infectiei cu virusuri citocide, iar retravirusurile produc perturbari minime. Intre cele doua extreme se situeaza raporturile celorlalte virusuri cu substratul in care se multiplica.

Mecanismele moleculare ale intreruperii sintezei proteinelor celulare si ale schimbarii specificitatii aparatului de sinteza celulara sunt multiple.

Virusurile citocide (polio, herpes, adeno, vaccinal) intrerup selectiv sinteza proteinelor celulare prin mai multe mecanisme:

inhiba traducerea mesagerilor celulari

inactiveaza factorii specifici ai sintezelor celulare;

prin transcrierea si traducerea preferentiala a mesagerilor virali.

Mecanismul traducerii discriminatorii intre ARNm celular si ARNm viral a fost dedus din faptul ca inhibitia sintezei proteinelor celulare este prea rapida pentru a fi atribuita numai scaderii cantitative a ARNm sau inhibitiei sintezei sale (herpes, vaccinal, rinovirus) :

ARNm al adenovirusurilor este asemanator cu ARNm celular si este foarte eficient in

competitia traducerii cu mesagerii celulari;

in celulele infectate cu virusul polio sau cu virusuri herpetice se produce dezagregarea selectiva a polisomilor celulari. Ribosomii raman functionali si disponibili pentru sinteza proteinelor virale. Pe masura ce sinteza proteinelor virale devine detectabila, apare o noua clasa de polisomi, mai mari, corespunzatoare ARNm viral, care este mai mare decat dimensiunea medie a ARNm celular ;

traducerea ARNm al picornavirusurilor este independenta de secventa de bonetare 5'. ARNm are o secventa lunga 5' necodificatoare ce contine un situs intern de intrare a ribosomilor.

Aproape totdeauna, in celula infectata se sintetizeaza o cantitate totala de proteine, mai mica decat in celula normala, deoarece, in general, infectia diminua capacitatea de sinteza proteica.

In multe cazuri, inhibitia sintezei proteinelor are rolul de a inhiba raspunsul antiviral al celulei, iar traducerea preferentiala a ARNm viral este consecinta adaptarii virusurilor la replicarea in prezenta actiunii unor astfel de mecanisme inhibitorii.

Aproape toate ribovirusurile, in ciclul replicarii, produc molecule de ARN dublu catenar. Raspunsul celulei gazda la ARN dc este inhibitia sintezei proteice, mediata de o fosfo-chinaza dependenta de ARN (PKR). PKR este, in esenta, o chinaza indusa de IFN, dar cele mai multe celule exprima constitutiv nivele semnificative ale acestei proteine. Rolul ei este de a activa raspunsul celulei la ARN dc, chiar in absenta IFN. In prezenta ARN dc, PKR fosforileaza subunitatea a a eIF₂ si initierea traducerii este astfel blocata.

Pierderea functiilor normale ale membranelor celulare

Virusurile altereaza membrana celulei gazda, pe doua cai:

modifica permeabilitatea membranei citoplasmatice;

induc fuziunea membranei cu celulele invecinate.

Ambele procese sunt rezultatul diminuarii sau stoparii biosintezelor proprii celulei, precum si al inlocuirii proteinelor celulare membranare, cu glicoproteine ale peplosului viral. Astfel se perturba echilibrul mediului ionic intracelular, diminua rata transportului nutrientilor in celula si a eliminarii produsilor de catabolism.

Cele mai evidente modificari ale membranei citoplasmatice sunt detectabile la celulele infectate cu virusuri invelite (herpes, mixo-, paramixovirusuri). Celulele au frecvent tendinta de a fuziona, producand uneori sincitii gigante sub forma unor mase mari de citoplasma, delimitate de o membrana, care pot include zeci sau chiar sute de nuclei.

Procesul fuziunii celulare poate fi indus de proteinele invelisului viral, in special in cazul in care invelisul contine proteine de origine celulara. Fuziunea a fost studiata in culturi de celule infectate cu virusul Sendai (un paramixovirus), care actioneaza cu mare eficienta, ca agent fuzionant. Dupa multiplicarea virala, sincitiile se lizeaza.

Procesul de fuziune celulara a fost studiat dupa infectia substratului celular cu virusul inactivat prin iradiere. Virusul iradiat isi pierde capacitatea de multiplicare, dar si-o pastreaza pe cea hemaglutinanta si fuzionanta. Un virion in raporturi spatiale stranse cu doua celule, favorizeaza formarea unei punti membranare ce se extinde treptat, rezultatul fiind fuziunea completa a celor doua celule.

Factorul fuzionant al invelisului paramixovirusurilor este o proteina specifica polifunctionala (proteina F), implicata in initierea procesului infectios, prin fuziunea invelisului viral cu membrana celulei sensibile, in hemoliza virala si in fuziunea celulara. Proteina F isi exercita efectul fuzionant, numai daca este inclavata in dublul strat lipidic al invelisului viral si daca este mentinuta in contact strans cu membrana celulara, prin intermediul hemaglutininelor.

Fuziunea "din exterior" se produce numai dupa expunerea celulelor sensibile la doze mari de virioni infectiosi sau inactivati (cateva mii de particule/celula).

Infectia naturala se face totdeauna cu un numar mic de virioni si fuziunea este tardiva, dupa desfasurarea ciclului de multiplicare. Fuziunea este mediata de glicoproteinele virale inserate in membrana. Este asa numita "fuziune din interior", a carei consecinta este formarea sincitiilor sau policariocitelor. Efectul fuzionant este foarte evident la Paramyxovirus si Pneumovirus (virusul respirator sincitial).

Scaderea rezistentei membranelor lizosomale determina eliberarea enzimelor hidrolitice in citoplasma si prin aceasta, agravarea celorlalte mecanisme de producere a ECP.

In celula animala, modificarile lizosomale evolueaza in doua etape: a)cresterea permeabilitatii membranelor (cu pastrarea continutului enzimatic); b)difuzia enzimelor lizosomale in citoplasma si absorbtia lor secundara in nucleul celulei infectate, asociata cu modificari morfologice (rotunjirea celulei) si pierderea afinitatii pentru colorantii vitali.

Modificari ale citoscheletului

In timpul infectiei, majoritatea ribovirusurilor induc modificari morfologice pronuntate, al caror rezultat este rotunjirea celulei. Modificarile se datoreaza actiunii unor molecule virale, asupra componentelor citoscheletului sau sunt cauzate de inducerea apoptozei.

Citoscheletul este format din 3 elemente structurale: microfilamente, microtubuli si filamente intermediare. Microfilamentele sunt alcatuite din subunitati de actina, iar microtubulii sunt formati din tubulina. Aceste elemente au rol structural, de transport intracelular, de mobilizare a organitelor si sunt comune marii majoritati a tipurilor celulare. Filamentele intermediare sunt formate din subunitati de citocheratina si sunt specifice pentru starea de diferentiere celulara.

Dupa infectia virala, frecvent se produce ruperea unuia sau mai multor sisteme de fibre ale citoscheletului, in special a microfilamentelor de actina. Proteaza 3C a virusului polio si proteina M a VSV care determina inhibitia sintezei ARN celular, cliveaza proteina asociata microtubulilor si celulele se rotunjesc. Dupa infectie, matricea nucleara de dezorganizeaza, iar efectul se manifesta in redistribuirea cromatinei.

4. Apoptoza este consecinta inhibitiei expresiei genelor celulare, indusa de virusuri sau se datoreaza raspunsului antiviral al gazdei.

In infectia cu virusul influenza, apoptoza se datoreaza raspunsului antiviral al celulei: pe suprafata celulei este indusa expresia receptorului Fas si a ligandului Fas. Dupa legarea la ligandul Fas, receptorul Fas induce semnalul proapoptotic.

Apoptoza este indusa de doi factori ai virusului influenza: ARN dc si NA. Inducerea expresiei receptorului Fas este parte a raspunsului gazdei la ARN dc si este mediata cel putin partial de PKR.

In celulele infectate cu VSV, unul dintre factorii inductori ai apoptozei este proteina M, inhibitoare a expresiei genelor si a dezorganizarii citoscheletului, dar raspunsul celulei la ARN dc si in special activarea PKR au rol la fel de important.

Aparitia corpilor de incluziune

Corpii de incluziune sunt structuri celulare neoformate dupa infectie, in masa carora se acumuleaza componente virale. Prin localizare, incluziile reflecta situsul multiplicarii virale.

Incluziunile virale au proprietati tinctoriale noi. Dupa forma pot fi sferice, ovalare, piriforme sau nedefinite, in functie de virusul infectant. Dimensiunile lor sunt cuprinse intre l si 30 m, ceea ce le face vizibile la microscopul optic. Unice sau multiple, ele sunt dispuse in citoplasma (in celulele infectate cu poxvirusuri, ribovirusuri), in nucleu (in celulele infectate cu dezoxiribovirusuri) sau au localizare mixta (in celulele infectate cu orthomixovirusuri). Unele incluziuni sunt mai cunoscute dupa numele autorilor care le-au descris: corpii Babes-Negri (virusul rabic), corpii Guarnieri (virusul vaccinal), incluziunile Cowdry (virusul herpes).

Semnificatia biologica a incluziunilor virale este evidenta si din faptul ca ele se dezvolta pe masura progresiei ciclului de multiplicare. Incluziunile sunt markeri structurali ai procesului dinamic prin care celula produce virus. Ele reprezinta, in general, "fabricile de virus" in care are loc sinteza componentelor virale (acizi nucleici, proteine) si are loc morfogeneza virionilor.

Prin specificitatea si localizarea lor, incluziunile indica sediile celulare ale multiplicarii virale. Ele sunt un indicator util pentru demonstrarea naturii virale a unor leziuni celulare, iar morfologia si dispozitia lor caracteristica in anumite celule, constituie un important criteriu de diagnostic in unele viroze. Astfel, punerea in evidenta a incluziunilor rabice (corpusculii Babes-Negri) in neuronii din cornul lui Ammon, permite precizarea diagnosticului de turbare la omul si animalele suspectate de a fi murit in urma infectiei cu acest virus.