MICROORGANISMELE IMPLICATE IN PROCESELE FERMENTATIVE

MICROORGANISMELE IMPLICATE IN PROCESELE FERMENTATIVE

Microorganismele implicate in diferite tipuri de fermentatii pot fi studiate in stare vie (preparate umede) sau in stare nevie (preparate uscate).

Preparatele umede permit observarea formei, dimensiunilor si a miscarilor efectuate de microorganisme. Pentru a nu afecta viabilitatea, nu se folosesc coloranti si de aceea, la bacteriile transparente nu apare bine delimitat conturul si forma. Nu se pot pastra timp indelungat si prezinta pericol de contaminare.

Preparatele uscate numite frotiuri sunt fixate si colorate, si pot fi pastrate timp indelungat, fara pericol de infectie.

Obtinerea unui frotiu si analiza la microscopul cu imersie

Principiu. Preparatele uscate se pot obtine la diferite specii de microorganisme cu rol in desfasurarea proceselor fermentative sau la specii de bacterii existente in sol sau in nodozitatile de pe radacinile leguminoaselor.

Aparate si dispozitive microscop cu obiectiv pentru imersie (x 90).

Materiale necesare lama de sticla, ansa, bec de gaz, mediu bacterian, baie de colorat, hartie sugativa, violet de gentiana, ulei de cedru sau de ricin, panza moale.

Modul de lucru Pentru a asigura conditii perfecte de sterilizare se foloseste o lama de sticla bine degresata in flacara unui bec de gaz si o ansa (ac metalic prevazut cu o bucla) care se sterilizeaza pana la rosu in flacara unui bec. Pentru obtinerea unui frotiu si pentru analiza lui microscopica, se fac urmatoarele operatii;

a - Etalarea. Din mediul bacterian se ia o portiune, cu ajutorul ansei, si se pune pe o lama de sticla, in 2-3 locuri, in jurul unei picaturi de apa. Cu ansa se amesteca cu apa intinzandu-se pe lama intr-un strat subtire si uniform.

b - Uscarea. Se efectuiaza frecvent la temperatura camerei.

c - Fixarea. Se face la o lampa de spirt sau bec de gaz, cu o flacara mica, prin descrierea cu lama de sticla a 3-4 cercuri prin flacara, cu miscari lente, realizand astfel omorarea microorganismelor si lipirea lor de lama de sticla.

d - Colorarea. Lama de sticla cu materialul biologic fixat se aseaza pe suportul baii de colorat si se acopera cu o hartie sugativa taiata in forma lamei. Peste hartie sugativa se toarna solutia de colorant (violet de gentiana sau fuxina) pana la imbibarea uniforma a sugativei, excesul de colorant fiind colectat in baie. Timp de 5 minute se obtine un compus iodat care se fixeaza foarte energic in corpul bacteriei si nu poate fi spalat cu apa sau cu solventi organici (alcool, acetona). Aceasta este coloratia Gram, iar bacteriile care raman colorate in violet se numesc gram-pozitive. Preparatul obtinut se spala cu apa si se usuca la temperatura camerei.

e - Analiza la microscopul cu imersie. Preparatul uscat, fixat si colorat, se acopera cu 1-2 picaturi de ulei de cedru sau ulei de ricin care prezinta acelasi indice de refractie ca si sticla, concentreaza razele in lentila microscopului si constituie inca o lentila care mareste obiectul examinat. Dupa reglarea luminii prin manevrarea oglinzii, se coboara obiectivul pana ce atinge picatura de ulei.

Apoi se ridica obiectivul de la surubul macrometric pana apare imaginea clara. Reglarea intensitatii luminii se realizeaza prin deplasarea condensatorului si prin deschiderea irisului. Dupa examinarea preparatului se sterge obiectivul cu o sugativa umeda si se usuca cu o panza curata si moale.

Durata experientei: 20 minute.

Studiul morfologic al microorganismelor prin metoda frotiurilor

Principiu. Diferite tipuri de fermentatii sunt declansate de prezenta anumitor bacterii sau ciuperci, aerobe sau anaerobe, care contin enzime specifice implicate in aceste fermentatii. Studiul lor se face la microscopul cu imersie prin analiza preparatelor uscate (frotiuri).

1. Punerea in evidenta a microorganismelor din fermentatia alcoolica

Modul de lucru: Se pregateste un frotiu pe baza unui extract de fermentatie alcoolica din zaharoza si drojdie de bere (Saccharomyces cerevisiae si S. ellipsoideus). La microscopul cu imersie apar ciuperci monocelulare de forma ovala, cu dimensiuni mari, colorate in violet intens, unele celule fiind inlantuite (inmugurite).

2. Punerea in evidenta a bacteriilor lactice.

Modul de lucru. Pe lame de sticla diferite, se pun extracte de fermentatie lactica pe baza de zer din lapte smantanit, saramura de castraveti murati sau saramura de varza murata. Analizele frotiurilor la microscopul cu imersie permit stabilirea particularitatilor morfologice ale bacteriilor:

- In zerul de lapte acrit se constata prezenta bacteriilor: Streptococcus lactis (celule mici, ovale, dispuse in siraguri de margele); Bacterium bulgarium (celule mari si alungite) si uneori Oidium lactis (celule mari cu forme dreptunghiulare), care apar in laptele acru invechit si oxidat, si provoaca degradarea acidului lactic in acid butiric cu miros neplacut sau se descompune total pana la CO₂ si H₂O (fig. 91).

Fig. 91 - Modfologia unor bacterii lactice

a - Streptococcus lactis; b - Bacterium bulgaricum

In saramura se constata prezenta urmatoarelor microorganisme: Bacterium cucumeris fermentati (celule foarte mici, in forma de bastonase, grupate in perechi sau lantisoare) la castraveti murati; Lactobacterium plantarum la gogonele murate; Bacterium brassicae la varza murata; Lactobacterium sisteri la mere murate.

3. Identificarea bacteriilor din fermentatia butirica.

Modul de lucru. Pe o lama de sticla se pun 1-2 picaturi din extract de fermentatie butirica, pregatit din cartofi. Se adauga solutie Lugol, se acopera cu lamela si se examineaza la microscopul cu imersie prin picurarea uleiului de cedru sau ricin pe suprafata lamelei. Se constata prezenta microorganismelor din specia Bacterium amylobacter (celule in forma de bastonase scurte si ingrosate la mijloc) (fig. 92).

Fig.92 Morfologia bacteriilor fermentatiei butirice

4. Identificarea bacteriilor din fermentatia acetica.

Modul de lucru. Din extractul de fermentatie acetica , se pun 1-2 picaturi pe o lama de sticla, se coloreaza cu solutie Lugol, se pune lamela si se observa la microscopul cu imersie culoarea membranelor celulare. Daca membranele externe se coloreaza in albastru, preparatul contine speciile Bacterium pasteurianum si Bacterium ktzingianum, iar daca membranele se coloreaza in galben, preparatul contine Bacterium aceti si B. ranceum.