Fermentatia alcoolica

Fermentatia alcoolica

Fermentatia alcoolica este un proces anaerob prin care glucidele fermentescibile sunt metabolizate prin reactii de oxido-reducere sub actiunea echipamentului enzimatic al drojdiei in produsii principali (alcool etilic si CO₂) iar ca produsi secundari: alcooli superiori, acizi, aldehide s.a.

Agentii tipici ai fermentatiei alcoolice sunt drojdiile genului Saccharomyces care pot sa produca prin fermentarea glucidelor mai mult de 8 alcool etilic.

Fermentatia alcoolica este un proces intalnit la numeroase microorganisme, dar care produc prin fermentare cantitati mai reduse de alcool etilic comparativ cu drojdiile. Astfel mai pot produce alcool etilic bacteriile: Bacillus macerans, Cl. acetonoetilicus, Zymomonas dar ele nu sunt considerate agenti tipici .

Proprietati biotehnologice ale drojdiilor fermentative

Pentru a putea fi folosite in practica drojdiile genului Saccharomyces sunt studiate si selectionate in functie de unele proprietati care le recomanda pentru utilizare industriala, cum ar fi:

Puterea alcooligena care se refera la concentratia mare de alcool ce se poate acumula cand in mediu exista un exces de zahar. Drojdiile sunt sensibile la cresterea concentratiei in alcool si in timp ce drojdiile cu putere alcooligena slaba (Kloeckera, Torulopsis) sunt inhibate la o concentratie in alcool de 4-6 drojdiile de vin si spirt (Saccharomyces cerevisiae var. ellipsoideus., Saccharomyces cerevisiae-cerevisiae] au o putere alcooligena mare si continua fermentatia alcoolica pana se acumuleaza 16-18 alcool.

Alcoolorezistenta se refera la capacitatea drojdiei de a continua fermentatia la cresterea concentratiei de alcool si de a demara fermentatia in prezenta de 8% alcool.

Sulfitorezistenta este capacitatea drojdiilor de vin de a produce fermentatia alcoolica o proprietate importanta a drojdiilor de vin care in prezenta unor concentratii de 200-500 mg SO₂dm-³ pot influenza negativ activitatea altor drojdii din must neadaptate (peliculare sau oxidative) ca urmare a scaderii potenpalului de oxidoreducere.

Se presupune ca rezistenta la SO₂ este datorata si capacitatii acestor drojdii de a excreta aldehida acetica ce poate lega SO₂ care astfel isi reduce efectul levuristatic.

Capacitatea de floculare si pulverulenta - proprietati datorate structurii peretelui celular si a modificarii de pH si rH din timpul fermentatiei. Drojdiile floculante pot forma asociatii ce se depun mai usor, in timp ce drojdiile pulverulente se mentin mai mult timp in suspensie si produc o fermentatie mai avansata. Pentru drojdiile de sampanie se urmareste ca aceasta sa se depuna usor in gatul sticlei si prin operatia de degorjare sa se separe sedimentul, obtinandu-se o sampanie limpede.

Osmotoleranta se refera la capacitatea drojdiilor de a produce fermentatia in mediu cu concentratie crescuta de zahar. Aceste proprietati sunt recomandate drojdiilor folosite la obtinerea spirtului din melasa cu un randament superior in alcool etilic.

Frigofilia este o adaptare a drojdiilor de a produce fermentatia la temperaturi mai scazute de 10-15C; astfel sunt evitate fermentatii secundare iar in vin se acumuleaza mai multe substante de aroma.

Caracterul killer este intalnit la unele drojdii capabile de a sinteza intracelular o toxina cu efect inhibitor asupra altor drojdii sensibile. In selectionarea drojdiilor de vin culturile care au caracter k dau randamente superioare deoarece in cursul fermentatiei are loc o autoselectie naturala.

Factorii care influenteaza dinamica fermentatiei alcoolice

Fermentatia alcoolica in conditi industriale foloseste substraturi naturale bogate in zahar fermentescibil, iar viteza de fermentare si transformare a glucidelor in produsi primari si secundari este dependenta de numerosi factori care pot fi impartiti in doua mari categorii: factori biologici, dependent de microagentii fermentarii, si factori fizico-chimici, dependentt de compozitia mediului supus fermentarii si conditiile mediului ambiant.

Factorii biologici

Inca din 1885-1887 a fost stabilit de catre Ed. Bchner ca fermentatia alcoolica este cauzata de enzimele elaborate de celula de drojdie, stabilindu-se natura enzimatica a fermentatiei.

Efectul Pasteur este mai evident la specii de drojdii la care glicoliza este mai putin eficienta, in timp ce pentru drojdiile cu metabolism fermentativ puternic, acest efect este mai putin important, deoarece enzimele ce intervin in respiratie (aeroba) sunt supuse represiei in prezenta glucozei din mediu. (Zimmermann F., 1997)

In practica vinificarii, atunci cand fermentatia decurge lent, ca rezultat al prezentei in mediu a unui numar mai mic de celule, se poate stimula cresterea de celule prin aerare. In industrii fermentative (spirt, vin, bere) nu se urmareste obtinerea de biomasa celulara, de aceea conditiile sunt anaerobe, astfel incat o cantitate mai mare de zahar este transformata in alcool etilic, iar cantitatea de drojdie reziduala la sfarsitul fermentarii este in cantitate mai mica.

Sacch. cerevisiae, in conditii strict anaerobe nu creste mai mult de 2-3 generatii. Drojdia necesita cantitati reduse de oxigen pentru sinteza de steroli cu rol de intermediari in biosinteza. In absenta oxigenului, mediul trebuie sa fie suplimentat cu ergosterol si acizi grasi pentru continuarea cresterii celulare.

Fermentatia alcoolica este influentata si de factori chimici si fizici, care actioneaza atat asupra vitezei de fermentare cat si asupra bilantului masic si a raportului dintre produsii primari si secundari.

Influenta factorilor fizico-chimici asupra fermentatiei alcoolice

Compozitia mediului de fermentare. Diferitele componente ale mediului pot fi metabolizate in mod diferit. De aceea, mai ales la vinuri, in functie de calitatea mustului, care este influentata de soiul si gradul de coacere a strugurilor, apar diferente de aroma.

Concentratia in zahar influenteaza direct proportional viteza de fermentare atunci cand se situeaza in limitele 5-12% (50-120 g zahar.dm'³). Cu cresterea concentratiei de zahar anumite drojdii mai sensibile sufera o inhibare in activitate prin procese de represie catabolica sau prin modificari la nivel de membrana datorate plasmolizei. Drojdiile de fermentare au in general osmotoleranta si de aceea produc fermentarea in bune conditii a mustului de struguri cu o concentratie de 170-250 g zahar.dm^-3.

In fermentatia alcoolica industriala se folosesc diferite produse bogate in zahar, medii naturale ce contin si alte substante necesare pentru mentinerea activa si nutritia celulelor.

   Astfel, daca mustul de struguri este folosit ca lichid fermentescibil

               la fabricarea vinului, la fabricarea berii se foloseste mustul de malt

               ce contine maltoza (80% din substanta solubila).

               In industria spirtului si la obtinerea drojdiei comprimate se foloseste ca mediu de baza melasa, care are un continut de 45-55% zaharoza
necristalizata.

               Plamezile amidonoase pentru a putea fi folosite in fermentatie trebuie sa sufere mai intai o hidroliza enzimatica in urma careia se obtine glucoza, maltoza, dextrine cu molecule mici, care sunt apoi transformate in alcool etilic.

               Zerul rezultat la fabricarea branzeturilor, cu un continut de 4,7% lactoza, poate fi folosit la obtinerea de alcool etilic folosindu-se drept agenti de fermentare drojdii din genul KLuyveromyces producatoare de lactaza.

               Celuloza poate fi folosita drept substrat la obtinerea alcoolului carburant dupa hidroliza chimica si enzimatica din care rezulta celobioza si cellodextrine ce pot fi fermentate de catre drojdii.

Concentratia in alcool. In mediile fermentative cu microbiota naturala,
daca se ajunge la o concentratie alcoolica de 4-6, se produce o incetinire a fermentarii
la drojdii care nu au rezistenta la alcool (Kloeckera, Torulopsis, Hansenula), iar
fermentarea este continuata de drojdii alcoolorezistente, acumulandu-se 18-20 alcool
(1 grad alcoolic = 1cm³. alcool absolut/100 cm³ mediu fermentat).

La cresterea concentratiei in alcool se poate produce o solubilizare a lipidelor situate la nivelul membranei plasmatice, creste permeabilitatea la ioni si metaboliti cu molecule mici si este inhibat transportul (absorbtia) glucidelor. Alcoolul poate actiona ca un denaturant al proteinelor si ca agent de inactivare a enzimelor.

Sensibilitatea drojdiilor la efectul de inhibare dat de alcool creste cu marirea temperaturii.

Drojdiile din genul Saccharomyces (Saccharomycces cerevisiae) prezinta o toleranta la acool determinata genetic.

PH-ul are un rol important in formarea compusilor de fermentare, in functie de pH cunoscandu-se doua forme ale fermentarii: fermentarea alcoolica propriu-zisa, ce se desfasoara la pH 3,5-5 cand produsul principal este alcool etilic si dioxidul de carbon, cu produsi secundari in cantitati mici, echilibrate si fermentarea la pH alcalin, cand in afara de alcool etilic si dioxid de carbon se formeaza in cantitate mai mare glicerol (pana la 30% din zaharul fermentat).

Mustul de struguri are un pH acid (≡ 3,6) de aceea la fabricarea vinurilor drojdiile sunt avantajate si au cele mai bune conditii de dezvoltare si activitate metabolica.

Substantele chimice existente sau adaugate mediului pot influenta procesul fermentativ.

Fosfatii au o influenza pozitiva deoarece participa la formarea acizilor adenilici, contribuie la formarea esterilor fosforici ai glucidelor, forme in care acestea sunt transportate in celula si fermentate.

Dioxidul de sulf se adauga in cantitati de 200-500 mg.dm^-3 pentru a permite
activitatea drojdiilor fermentative care, spre deosebire de alte drojdii, sunt
sulfitorezistente. In concentratii admise de tehnologie, SO₂ influenteaza viteza de
fermentare, favorizand activitatea drojdiilor tipice. Daca doza de SO₂ introdusa este accidental mai mare, fermentarea alcoolica este deviata de la forma de baza deoarece dioxidul de sulf se combina cu aldehida acetica, ceea ce conduce la formarea in exces a glicerolului, a acidului acetic si a unor cantitati mai mici de alcool etilic.

Temperatura. Enzimele componente ale sistemul zimazic prezinta fiecare un optim de activitate, iar proprietatile sunt determinate genetic de caracterele de specie. Fermentarea alcoolica poate avea loc intre 0-35C. In functie de specia de drojdie predominanta sau folosita in cultura pura temperaturile optime sunt la:

         28-30C, pentru drojdia de spirt si de panificafie (Saccharomyces cerevisiae)

         6-12C, pentru drojdia de bere (Saccharomyces carlbergensis)

         15-20C, pentru drojdiile de vin (Saccharomyces cerevisiae

varellipsoideus si Sacch), care produc o fermentare mai lenta la aceste temperaturi, dar conduc la obtinerea unui vin de calitate deoarece la temperaturi mai scazute se evita pierderile de substance volatile.

Biochimismul formarii produsilor principali secundari in fermentatia alcoolica propriu-zisa.

Conversia prin fermentare in mediu acid a glucidelor, catalizata de enzime din drojdii se desfasoara in cinci etape principale:

Transformarea diferitelor tipuri de glucide in esteri ai glucozei si formarea esterului fructo-furanozo-l,6-difosfat. Este etapa in care se consuma energie prin transformarea ATP-ului in ADP.

Formarea triozelor - aldehida fosfoglicerica si fosfodioxiacetona.

Transformarea triozelor pana la formarea de acid piruvic. Energia eliberata
prin procesul de oxido-reducere este inmagazinata prin fosforilare de substrat.

Decarboxilarea acidului piruvic si formarea de aldehida acetica.

Aldehida acetica se reduce devenind acceptor de hidrogen si se formeaza
alcoolul etilic.

Reactia globala a fermentatiei alcoolice in mediu acid:

2ADP+2P
C₆H₁₂O₆ > 2C₂H₅OH + 2 CO₂ + 2 ATP (117 kj/mol)

Formarea produsilor secundari

In fermentatia alcoolica rezulta o diversitate de produse secundare. In vinuri au fost identificate prin cromatografie 300-500 de substance diferite. Majoritatea lor rezulta prin fermentare, iar celelalte sunt dependente de compozi^ia mediului.

Complexul zimazic celular obtinut prin mojararea celulelor de drojdie(este format din 15 enzime care catalizeaza in diferite etape, procesele de oxidoreducere ale glucidelor fermentescibile si in final formarea de alcool etilic.

Enzimele cele mai importante sunt dehidrogenazele: glicerat-dehidrogenaza si alcool dehidrogenaza care au drept coenzima NAD⁺, cu rol in transfer de hidrogen in reacjiile de catabolism.

Fermentatia decurge activ cand celulele de drojdie sunt in faza exponentiala sau la inceputul fazei stationare de crestere, in timp ce drojdiile autolizate, ca rezultat al hidrolizei proteinelor intracelulare si inactivarea enzimelor, isi pierd proprietatile fermentative. Viteza de fermentare depinde si de numarul de celule/cm³ mediu; viteza creste cu numarul de celule, prin viteza intelegand continutul de alcool format la 100 cm³ lichid in unitatea de timp. In practica, din radium economice, prin folosirea culturilor starter in industriile fermentative, concentrajia de celule pentru declansarea rapida a fermentatiei este 10⁶-10⁷cnr³.

Un alt factor il constituie spectrul de fermentare al glucidelor. Din studiul caracterelor fiziologice se cunoaste ca drojdiile produc fermentarea unui numar limitat de glucide ce pot fi transformate in alcool etilic si CO₂ in conditi anaerobe, intre specii existand diferenje.

Drojdiile fermentative au un spectra limitat de glucide. Astfel toate tulpinile de Saccharomyces cerevisiae pot fermenta D-glucoza, D-manoza si D-fructofuranoza (fara sa poata folosi D-fructopiranoza) si sa le asimileze in conditii aerobe cand acestea reprezinta sursa unica de carbon. In aerobioza, dupa epuizarea glucidelor drojdiile pot asimila alcoolul etilic.

Spre deosebire de membrana plasmica, peretele celular al drojdiei este permeabil pentru glucide. Se estimeaza ca fluxul de transport al D-glucozei prin membrana plasmatica a lui Saccharomyces cerevisiae in timpul cresterii este de 120-240 n.mol min'¹ (mg.su.drojdie)'¹

Permeazele pentru transferal D-glucozei, D-manozei si D-fructozei sunt constitutive si asigura transferal prin difuzie facilitata in timp ce transportul pentru D-galactoza este inductiv. Diglucidele si dintre triglucide - rafmoza, sunt hidrolizate de catre enzimele simple drojdiei in glucide simple.

Zaharoza si rafmoza sunt hidrolizate sub ac|iunea invertazei situata la nivelul peretelui celular dar exista evidence privind existenta unui transportor specific pentru zaharoza. Se cunosc 2 forme de invertaza si anume o invertaza localizata in spatiul periplasmic care este responsabila pentru hidroliza extracelulara a zaharozei si o forma secundara de invertaza, intracelulara.

Invertaza este supusa represiei de catre glucoza incat daca D-glucoza este disponibila in mediu nu poate fi pusa in evidenta activitate invertazica extracelulara.

Maltoza este hidrolizata intracelular dupa ce are loc o absorbtie specifica de catre maltozopermeaza, actioneaza apoi maltaza (a-glucosidaza); ambele enzime sunt inductibile (Zimmerman F.K, Entian KD, 1997).

Datorita importantei pe care o prezinta alcoolul etilic de fermentare in practica industriala, in afara glucidelor fermentescibile se pot folosi substraturi naturale ce contin poliglucide (amidon, celuloza) care sunt hidrolizate in prealabil pe cale chimica sau enzimatica pana la formarea de glucide fermentescibile.

Aceasta zaharificare este obligatorie deoarece drojdiile de fermentare nu produc amilaze/celulaze si nu pot produce hidroliza enzimatica a poliglucidelor.

Un alt factor biologic este corelat cu comportarea drojdiilor fermentative in functie de accesul oxigenului in mediul supus fermentarii. In conditii anaerobe, prin imersare in must, celulele de drojdie produc fermentarea glucidelor obtinand o cantitate mica de energie (2 moli ATP/mol glucoza fermentata). De aceea, ele trebuie sa prelucreze o cantitate mai mare de zahar pentru a ob|ine energie, iar cresterea numarului de celule are loc foarte lent.

Daca mediul de fermentare este puternic aerat, atunci are loc efectul Pasteur prin care se observa conversia fermentatiei in respiratie deoarece in prezenta oxigenului, oxidarea se face pana la produsj finali (CO₂ si H₂O), iar cantitatea de energie este mult mai mare, pentru acelasi echivalent energetic consumandu-se o cantitate mai mica de zahar.

1 mol glucoza -> 2 ATP (fermentare)

1 mol glucoza -> 36 ATP (respiratie)

Procesul de aerare este folosit la cultivare atunci cand intereseaza obtinerea unei cantitatii mai mari de drojdie, de exemplu la obtinerea industriala a drojdiei comprimate sau a drojdiei furajere.

Dupa F. Ehrlich acest tip de reactie se aplica la toti acizii a-aminati si explica formarea de aldehide care prin reactii de oxido-reducere de tip Cannizzaro produc alcooli si acizi (MotocD,1962).

Alcoolii superiori rezulta atat din glucide, cat si din aminoacizi, acestia din

urma constituind sursa principala, dupa ecuatia.

-CO₂

R-CH₂-OH COOH + R CHO

Dintre alcoolii superiori, care se acumuleaza mai ales la fabricarea spirtului, fac parte alcoolii amilic, izoamilic, propanol, butanol, care pot sa contribuie la formarea unor substance de aroma.

La fabricarea vinului alcoolii superiori (~ 250 mg.dm^-3) sunt precursori de aroma deoarece se pot combina cu diferitri acizi rezultand esteri cu aroma caracteristica. De exemplu in vinuri, din fenilalanina se formeaza alcoolul feniletilic care da aroma de trandafir tinand cont de diversitatea aminoacizilor, se poate explica varietatea alcoolilorsi esterilor formati. Alcoolii superiori ce se obtin la fabricarea spirtului distila la 130C, obtinandu-se o fractiune de distilare denumita ulei de fuzel, folosit in industria vopselurilor. Diacetilul si acetoina se formeaza cand cantitatea de celule de drojdie este foarte mare. Prezenta in cantitati mici a acestor substance nu influenteaza calitatile senzoriale ale produsului. La concentratii de 0,4 ing.dm'³ se sesizeaza gustul de diacetil, iar la concentratii mai mari apar modificari senzoriale nedorite. Gustul este sesizat mai ales in bere unde se formeaza i sub actiunea unor bacterii contaminante.

Mercaptanii apar cand gruparea OH din alcooli este inlocuita cu gruparea SH. Prezenta acestor substance cu gust neplacut este datorata actiunii unor drojdii cu calitati nedorite, asupra compusilor cu sulf din mediile fermentative.

Ca rezultat al formarii produselor secundare, in industria fermentativa se obtin produse diversificate, apreciate prin calitati senzoriale si nutritive.

Bilantul masic al fermentatiei alcoolice

Teoretic, din ecuatia generala a fermentatiei alcoolice dintr-un mol de glucoza, rezulta ca produse principale 2 moli de alcool etilic si 2 moli de CO₂ si anume:f

180 g > 2x46 + 2x44

(Glucoza) (Etanol) (CO₂)

Randamentul teoretic arata ca din 100 g de glucoza se pot forma 51,1 g alcool etilic.

r = 92/180 -100 = 51,1

Un bilant apropiat de realitate este dat de Louis Pasteur (1860) care arata ca din 100 g de glucoza se obp.n prin fermenta|ie:

Alcool etilic 48,6 g

Dioxid de carbon 46,8 g

Glicerol 3,2 g

Acid succinic 0,2 g

Drojdii (subst. uscata) 1,2 g

In acest bilan|: nu se ine cont de formarea altor produsi secundari: acizi, alcooli superiori ..

In practica vinificatiei se considera ca prin fermentarea unui must cu un continut de 170 g glucide fermentescibile .dm'³ rezulta un vin cu 10 alcool. Pentru calcul:

1 grad alcoolic = 1 cm³ alcool absolut la 100 cm³

densitatea alcoolului absolut = 0,794

In cazul vinurilor albe un grad alcoolic rezulta din 16,67 g zahar fermentat.dm'³ iar in cazul celor rosii din 17,86 g.dnv³ (A.I. Popa, S. Teodorescu, 1990).

Glicerolul se acumuleaza in mod normal in cantitati de 3,3 g/100 g glucoza fermentata si are un rol benefic asupra calitatii vinului, conferindu-i 'catifelaj'-ul. Glicerolul se formeaza din fosfodioxiacetona in primele etape ale fermentarii, cand aldehida acetica se afla in cantitati mici.

Acizii provin atat din must cat si din procesul fermentativ. Ei dau aciditate volatila vinului (acid acetic, formic, propionic, butic) precum si o aciditate fixa (acid lactic, succinic) care se regases,te in aciditatea totala a vinului.

Acidul lactic se poate acumula in cantitati de 20 mg.dnr³ provenind din acidul piruvic care accepta H.

Acidul acetic se acumuleaza in cantitati de 80-120 mg.dnr³. El poate avea rol in formarea esterilor (acetat de etil), iar la concentratii mai mari determina modificari de gust, ceea ce conduce la deprecierea vinului.

Acidul succinic se formeaza prin bioconversia glucidelor (poate reprezenta 0,7% din cantitatea de zahar fermentat), fie din aminoacizi.

Din acidul glutamic prin dezaminare hidrolitica se elibereaza amoniacul ce poate fi folosit de drojdii ca sursa de azot si rezulta acidul hidroxiglutaric din care se poate forma acidul formic si aldehida succinica.