Continutul si rolul geneticii medicale

CONTINUTUL SI ROLUL GENETICII MEDICALE

Genetica medicala este domeniul din medicina care se ocupa cu descifrarea si cunoasterea naturii ereditare a bolilor umane. Ea studiaza structurile, mecanismele si legile de baza ale transmiterii ereditatii, a mesajului genetic de la o generatie la alta, atat pentru caracterele normale cat mai ales pentru cele patologice.

Termenul de 'genetica' a fost introdus in 1906 de catre W. Bateson, moment in care se redescopereau (confirmau) legile lui Mendel si cand Galton si Garrod (1902) introduceau pentru prima oara termenul de 'erori innascute de metabolism'.

In viziunea moderna, genetica medicala poate fi definita ca stiinta care se ocupa cu studiul mecanismelor de inregistrare, conservare si transmitere a informatiei ereditare de-a lungul generatiilor, precum si cu modificarile ereditatii sub actiunea factorilor mutageni si implicatiile acestora in etiologia bolilor ereditare si/sau cu predispozitie ereditara.

Astazi, cunostintele de genetica medicala servesc la intelegerea rolului jucat de gene (si separat, rolul mediului) in formarea caracterelor normale pe de o parte si in cauzalitatea (etiologia) bolilor ereditare, pe de alta parte. Prin studiul acestora, genetica medicala aduce date foarte pretioase in privinta implicatiilor factorilor genetici si a modificarilor acestora in patologia umana.

Cunostintele de genetica si aplicarea lor in medicina au o reala valoare pentru medicina clinica; conform datelor actuale se apreciaza ca aproximativ 1/3 din copiii bolnavi prezinta o boala genetica. Sunt deja bine etichetate peste 6000 de boli genetice. Din acestea, la peste 2500 se stie cu exactitate gena patologica (mutatia intragenica) si s-a reusit izolarea multor asemenea gene. Statisticile arata ca aproximativ 5-7 % din indivizii unei populatii prezinta o tulburare genetica, mai mult sau mai putin evidenta.

Cercetarile ultimelor trei decenii au mai identificat o seama de boli cu anomalii cromosomice. Studiindu-se aspectul cromosomilor in celulele embrionilor avortati, s-a stabilit ca la aproximativ 1/2 din toate avorturile spontane ale primului trimestru de sarcina, tesutul embrionar prezinta grave tulburari ale numarului sau structurii cromosomilor, acestea fiind cauza avortului spontan.

Amploarea cercetarilor de citogenetica si genetica moleculara din ultimele decenii au dus la consolidarea Geneticii clinice ca parte integranta a Geneticii medicale. Genetica clinica se ocupa cu domeniul sindromologiei si dismorfologiei din patologia genetica, cu posibilitatile de investigare si diagnosticare a bolilor din aceasta patologie, de asemenea cu modalitatile de prevenire a transmiterii tarelor ereditare la descendenti.

Data fiind frecventa mare a bolilor genetice si explozia cercetarilor efectuate in acest domeniu, genetica medicala a devenit specialitate de sine statatoare in medicina, cu coordonate bine definite.

Multiplele cercetari de genetica moleculara efectuate in marile centre de genetica din lume au facut posibil ca peste 98 % din componenta genomului uman, respectiv cartografierea acestuia, sa fie deja cunoscute. Aceasta recenta realizare largeste considerabil posibilitatile de cunoastere a mutatiilor genice din bolile ereditare. De mai multi ani, tehnologia performanta a geneticii medicale a creat premizele pentru initierea terapiei genice intr-o serie de boli ereditare.

In scopul diagnosticarii precoce si al profilaxiei bolilor ereditare, diagnosticul antenatal se practica pe scara tot mai larga. In acelasi context, se efectueaza studii screening in scopul depistarii imediat la nastere a bolilor genetice, a purtatorilor heterozigoti de gena recesiva si al instituirii unui tratament adecvat.

Studiile geneticii medicale in domeniul cancerogenezei au evidentiat inca de multi ani implicarea predispozitiei ereditare in etiopatogenia procesului canceros.

Investigatiile genetice impreuna cu consultul si sfatul genetic trebuie sa-si extinda aria de cuprindere in populatie, in scopul instituirii unei asigurari medicale corespunzatoare, a efectuarii unei reale profilaxii a bolilor ereditare.

Prin ereditate (de la latinescul hereditas) se intelege ansamblul de trasaturi, de caractere pe care parintii le transmit copiilor; cu alte cuvinte, acestea se transmit de la o generatie la alta, constituind mostenirea biologica. Ereditatea poate fi definita si ca insusirea organismelor vii de a produce urmasi asemanatori lor. Caracterele morfologice si functionale ale fiecarui organism constituie fenotipul, el fiind unic (propriu) pentru fiecare individ si constituindu-se pe baza genotipului, a ereditatii mostenite de la parinti; din imbinarea celor doua genomuri parentale se constituie un nou organism, dar niciodata identic cu cel al parintilor.

Genomul este totalitatea informatiei ereditare continuta in setul haploid al fiecarui gamet.

Prin genotip se intelege totalitatea genelor continute in moleculele de ADN mostenite prin cei doi gameti care au participat la fecundare (materialul matern si patern).

Fenotipul sumeaza totalitatea caracterelor morfologice, functionale, psihice, comportamentale ale unui organism, care s-au format pe baza interactiunii dintre genotip si factorii de mediu.

In constituirea tuturor caracterelor fenotipice intervine alaturi de ereditate si mediul cu o cota variabila. Exista unele caractere pur ereditare, ca de exemplu grupele sanguine eritrocitare, proteinele plasmatice s.a. Alte caractere sunt partial ereditare: inteligenta, comportamentul psihic etc. Foarte putine caractere se considera a fi determinate numai de factorii de mediu. Practic, in orice caracter exista o cota mai mare sau mai mica de componenta ereditara. In cazul caracterelor partial ereditare se vorbeste de mostenirea unei predispozitii genetice.

Genetica medicala se ocupa deci de toate aspectele intricarii ereditatii in constituirea caracterelor normale si mai ales a celor patologice, subliniind implicarea ereditatii in cauzalitatea bolilor genetice si a celor partial genetice.

In patologia umana, alaturi de numarul mare al bolilor genetice se adauga si bolile cu predispozitie genetica, a caror morbiditate este notabila in populatie. Ele au etiologie multifactoriala, in care se intrica componenta ereditara cu factori de mediu. Printre bolile cu predispozitie ereditara, boala coronariana - cardiopatia ischemica - infarctul miocardic, astmul bronsic, diabetul zaharat, hipertensiunea arteriala, bolile psihice s.a, au net caracter familial.

Clasificarea bolilor genetice

In raport cu cota de participare a ereditatii in etiologia bolilor, acestea se pot imparti in:

I.boli genetice;

II.boli partial genetice (boli comune, cu predispozitie ereditara).

I.     Bolile genetice se subimpart in:

boli genice:

a)    monogenice;

b)   poligenice, multifactoriale;

boli cromosomice:

a)  numerice;

b)  structurale.

1.a) Prin definitie, bolile monogenice sunt rezultatul unor mutatii genice in una sau ambele alele, putand avea expresie puternica - dominanta in fenotip, sau recesiva. Datele statistice releva ca frecventa bolilor monogenice este de aproximativ 5%; in acest procent sunt inglobate atat bolile monogenice cu expresie fenotipica de la nastere, cat si cele cu debut tardiv.

1.b) Bolile poligenice, multifactoriale rezulta prin cumularea actiunii mai multor gene cu diversi factori de mediu. Componenta ereditara este reprezentata de o predispozitie mostenita care creeaza organismului o vulnerabilitate fata de anumiti factori de mediu. Aceste boli denumite si partial genetice au caracter familial, remarcandu-se in anumite familii un risc de recurenta crescut.

Se estimeaza ca jumatate din defectele congenitale si majoritatea bolilor cronice ale adultului sunt de etiologie poligenica multifactoriala; cele mai multe statistici efectuate in Europa si SUA evidentiaza ca frecventa bolilor partial genetice este de 50 - 60 %.

Bolile cromosomice sunt insotite de alterari ale numarului sau structurii cromosomilor, vizibile microscopic si antreneaza dismorfogenezii si disfunctii organice importante, unele dintre acestea fiind patognomonice in raport cu cromosomul afectat.

In raport cu originea modificarilor cromosomice ele se subimpart in:

a) germinale (mostenite);

b) somatice (dobandite), care apar in tumorile canceroase.

In unele mutatii genice care antreneaza si modificari ale structurii cromosomului la acel nivel, ca de exemplu microdeletii, microduplicatii, anomaliile cromosomice pot fi submicroscopice, detectabile prin tehnici de citogenetica, combinate cu tehnici de genetica moleculara.

II. Bolile partial genetice sunt determinate simultan de tulburari ereditare si factori de mediu. In cele mai multe cazuri, zestrea ereditara nu prezinta gene patologice, ci doar anumite combinatii genice care prin prezenta lor confera organismului o susceptibilitate pentru boala, in prezenta unor factori de mediu favorizanti. Practic, susceptibilitatea este starea de predispozitie genetica ce se poate converti in boala in anumite conditii de mediu.

Studiile familiale statistice releva ca anumite combinatii genice din genotip pot constitui un potential pentru declansarea (debutul) unei boli. Astfel spre exemplu, indivizii de grupa sanguina 0I sunt mai susceptibili (sunt predispusi) pentru ulcer gastro-duodenal decat indivizii de grupa sanguina AII, BIII si ABIV. Continuand cu exemple tot din sfera tesutului sanguin, notam ca indivizii cu haptoglobine de tip Hp1-1 sunt mai sensibili la factorii mutageni (cancerigeni), cu alte cuvinte, mai susceptibili pentru a dezvolta leucemie decat indivizii cu alte combinatii genice pentru haptoglobine.

Pe de alta parte, s-a evidentiat ca organismele cu anumite haplotipuri HLA prezinta vulnerabilitate pentru unele boli, existand astfel o frecventa mai mare a unor stari patologice in anumite haplotipuri HLA.

In plus, multiple cercetari de genetica clinica au scos in evidenta de mai multi ani ca in declansarea si evolutia bolilor epigenetice, constitutia genetica proprie fiecarui individ joaca intotdeauna, un anume rol. Este bine cunoscut astfel ca anumite combinatii genice (normale, de altfel) creeaza o sensibilitate a organismului fata de factorii nocivi din mediu.

Intotdeauna mediul influenteaza expresia fenotipica a genotipului. Se poate spune atunci ca genotipul confera o norma de reactie a organismului fata de conditiile de mediu in care traieste. Plastic exprimat, genotipul este 'partitura', iar fenotipul 'simfonia' ce se realizeaza pe baza partiturii.

Istoricul geneticii

Gregor Mendel, in 1865, contureaza pentru prima data principiile ereditatii, efectuand experimente pe plante. Pe baza acestora, Mendel postuleaza ca fiecare organism prezinta factori ereditari, de la ambii genitori si care se transmit din generatie in generatie, ei stand la baza constituirii fenotipului.

Legile lui Mendel au aparut insa, intr-un moment cand nivelul de cunostinte si gradul de intelegere al contemporanilor sai erau mult prea elementare. Abia 35 de ani mai tarziu, trei mari cercetatori: Hugo De Vries (olandez), Carl Correns (german), E.Tschermack (austriac), simultan si independent unul de celalalt, obtin aceleasi rezultate experimentale, redescoperind astfel valabilitatea universala a legilor lui Mendel.

In 1902, Garrod (unul din fondatorii geneticii medicale), in paralel cu Bateson, efectueaza studii in alcaptonurie (boala metabolica) si introduce notiunea de erori innascute de metabolism, intuind astfel cauza ereditara in unele boli.

In 1906, Bateson introduce termenul de 'genetica', iar in 1909, Johannsen, contureaza pentru prima data notiunea de gena, socotind gena ca pe un echivalent al factorilor ereditari descrisi de Mendel.

Conceptul lui Garrod devine conturat clar odata cu studiile lui Beadle (1941) prin care se formuleaza ideea: 'o gena = o enzima', idee care ulterior, a fost general parafrazata 'o gena = o proteina'.

In deceniul al III-lea al secolului nostru, Thomas Hunt Morgan, efectuand experimente pe Drosophila, postuleaza mai multe principii privind localizarea genelor pe cromosomi si functionalitatea acestora in dependenta directa cu factorii mutageni. Aceste principii sunt inmanuncheate in teoria cromosomiala a ereditatii.

In 1944, Avery, McCarty si McLeold, experimentand pe bacterii si virusuri, dovedesc ca substratul material (biochimic) al ereditatii este reprezentat de acizii nucleici.

Din acest moment, analizele moleculare ale materialului genetic au facut progrese senzationale, culminand in 1953 cand J. Watson si F. Crick au reusit sa cunoasca si sa descrie structura moleculara a ADN; pentru aceasta descoperire ei au fost rasplatiti, in 1962, cu premiul Nobel.

In paralel cu studiile lor, alti cercetatori folosind tehnici de evidentiere a cromosomilor umani, au inceput sa exploreze rolul cromosomilor sexuali in dezvoltarea sexului cat si efectele anomaliilor cromosomilor in dezvoltarea mentala si reproductiva.

In 1956, Tjio si Levan, imbunatatind tehnicile de evidentiere a cromosomilor umani, stabilesc numarul normal al acestora in celulele umane.

In 1960, Lejeune confirma o veche ipoteza si anume ca anomaliile cromosomice constituie o parte importanta din cauzele patologiei umane.

Incepand cu 1970, progresele in citogenetica si genetica moleculara au luat un avant impresionant: cromosomii umani sunt catalogati dupa criterii internationale, li se recunoaste morfologia si structura; moleculele de ADN au ajuns sa fie studiate in intimitatea lor, sa fie manipulate, transformate ca structura dupa dorinta si chiar, sa poata fi sintetizate gene artificiale. Toate acestea cuprind domeniul ingineriei genetice, care, constituie baza initierii terapiei si corectarii bolilor ereditare.

Analizele citogenetice, moleculare, cat si studiile familiale sunt in centrul atentiei marelui 'Proiect de Genetica Umana' conform caruia odata cu stabilirea cartografierii genomului uman se vor putea face pasi importanti in cunoasterea etiopatogeniei bolilor ereditare si a profilaxiei acestora.

Era geneticii moleculare a inceput in 1970 odata cu descoperirea enzimelor endonucleaze si a cunoasterii rolului lor de a desface moleculele de ADN in fragmente mai scurte.

In 1972, Temin si Baltimore izoleaza revers-transcriptaza si stabilesc rolul acesteia in constructia (sinteza) de ADN complementar. Pe baza acelorasi descoperiri, autorii aduc completari Dogmei centrale a geneticii.

Intre 1975-1977, Southern imagineaza tehnica pentru difuziunea secventelor de ADN ceea ce a constituit un moment crucial pentru cercetarile structurii genelor.

In 1985, Mullis imagineaza tehnica PCR (polymerase chain reaction) pentru multiplicarea moleculelor de ADN.

In 1987, Kunkel reuseste sa cloneze pentru prima data gena patologica din miodistrofia Duchenne. In 1989 se va reusi clonarea genei pentru fibroza chistica.

In 1990 se initiaza primele proceduri pentru terapia genica in deficienta pentru adenozin-diaminaza (deficienta ADA), folosind ca vector un retrovirus.

Din 1992 si pana in prezent s-au derulat multiple alte cercetari in domeniul cartografierii genomului uman, al izolarii si evidentierii structurii genelor, de asemenea in gasirea metodelor adecvate pentru terapia genica; in anul 2000, componenta genomului uman si cartografierea acestuia au devenit complet cunoscute.

METODE DE STUDIU IN GENETICA MEDICALA

Materialul genetic se studiaza pe cateva nivele:

nivel molecular;

nivel morfo-clinic si morfo-functional;

nivel citogenetic;

nivel statistic, populational.

Nivelul molecular cuprinde totalitatea metodelor de studiu al acizilor nucleici, al structurii genelor normale si patologice, al functionalitatii acestora in transcriptie, translatie si in relatia gene-polipeptide, cat si tehnologiile folosite pentru clonarea de gene, pentru manipularea si vehicularea lor in anumite genotipuri.

Nivelul morfo-clinic cuprinde examenul clinic al bolnavului, urmarindu-se modul cum sunt constituite caracterele fenotipice pe aparate si sisteme, eventualele devieri fenotipice, incluzand si examinarea atenta a aspectului dermatoglifelor.

Nivelul citogenetic sumeaza totalitatea metodelor pentru evidentierea cariotipului, la cazurile suspicionate de anomalii cromosomice.

Cariotipul se poate evidentia prin:

metoda indirecta, efectuarea de culturi celulare din:

T  limfocite circulante;

T  fibroblaste din lichidul amniotic (prin amniocenteza);

T  vilozitati coriale;

T  maduva hematogena etc.

metoda directa, pentru maduva hematogena (evidentierea cariotipului din maduva hematogena se face in cazurile de hemopatii maligne).

Nivelul statistic cuprinde efectuarea anchetei familiale si studiul a cat mai multi membri ai familiei in vederea efectuarii arborelui genealogic (pedigree), cuprinzand 2-3-4 generatii.

Pe baza datelor statistice obtinute se pot evidentia: tipul mutatiei, modul de transmitere in generatii si eventualii purtatori ai tarei genetice (cu evaluarea riscului recurentei bolii la descendenti).

Nivelul statistic mai cuprinde si studii seriate pe un numar cat mai mare de gemeni (monozigoti si dizigoti) in vederea evaluarii heritabilitatii - a componentei ereditare - in constituirea caracterelor fenotipice normale si patologice.

Intreaga activitate depusa la Cabinetele de consult si sfat genetic urmareste stabilirea unui diagnostic corect, depistarea purtatorilor de tara genetica si acordarea sfatului genetic adecvat.

BAZELE MOLECULARE ALE EREDITATII

Structura si organizarea ADN-ului

In deceniul al IV-lea al secolului nostru, analizele moleculare ale materialului genetic au luat o amploare deosebita. La foarte scurt timp dupa ce Beadle (1941) formula conceptul " o gena = o enzima", se demonstreaza rolul genetic al acizilor nucleici, ca fiind suportul material al mesajului ereditar la toate vietuitoarele. S-a stabilit in acelasi timp, ca genele la eucariote sunt compuse din molecule de ADN.

Descoperirea rolului genetic al ADN a concentrat atentia cercetatorilor asupra structurii sale, fiind singura cale pentru intelegerea functionalitatii genelor.

In 1953, J.Watson si F.Crick au imaginat si demonstrat modelul structurii spatiale al ADN ca molecula bicatenara, helicoidala, formata din insiruiri de nucleotide.

ADN-ul este un macropolimer format din secventializari de dezoxiribonucleotide. Lungimea si greutatea moleculara sunt uriase, permitandu-se astfel stocarea unei impresionante informatii ereditare. Cantitatea de ADN variaza de la o specie la alta, dar este constanta in celulele aceleiasi specii.

Cea mai mare cantitate de ADN (aprox. 98 %) se gaseste in nucleu, respectiv in cromosomi. Un procent de aproximativ 2% il reprezinta ADN-ul mitocondrial din citoplasma.

Structura ADN de tip B

Structura primara este reprezentata de secventializarile nucleotidice. Fiecare nucleotid din cele patru tipuri constituie o unitate structurala si este format dintr-o baza purinica A sau G, sau pirimidinica C, respectiv T, o dezoxiriboza si un rest de acid fosforic.

Baza azotata impreuna cu dezoxiriboza de care este legata, formeaza un nucleozid. Polimerizarea celor patru tipuri de nucleotide este asigurata prin legaturi fosforice.

Secventializarea bazelor azotate este strict specifica si reprezinta ereditatea codificata. In schimb, axul fosfo-glucidic are structura variabila, el constituie scheletul moleculei, fiind asezat inspre exteriorul catenelor.

Secventializarea nucleotidelor in formarea catenei de ADN

Structura secundara este reprezentata de configuratia spatiala bicatenara, dublu helicoidala, formata prin asamblarea co-axiala, antiparalela si complementara a celor doua catene polinucleotidice (conform modelului descris de Watson si Crick, 1953) (Fig.8.b).

Complementaritatea catenelor este asigurata prin imperecherea riguros specifica a bazelor azotate, adenina si timina (A = T), legate prin doua legaturi de hidrogen, iar citozina si guanina prin trei legaturi de hidrogen (C G). Cele doua catene sunt antiparalele una fata de cealalta, prin orientarea in sens diferit a legaturilor fosforice; astfel, pe o catena acestea sunt 3^'-5^', iar pe cealalta 5^'-3^' (fig.8.b). Existenta acestui paralelism face ca in timpul transcriptiei sa fie copiata doar una din catene, niciodata amandoua.

Cele doua catene sunt infasurate in jurul unui ax, in chip helicoidal dextrogir, in care o spirala a helixului cuprinde zece perechi de nucleotide. In conditii fiziologice catenele au stabilitate buna. Experimental insa, la temperaturi de peste 90s, sau la modificari ale pH-ului, ADN-ul se denatureaza, devenind monocatenar.

Asemenea denaturari se folosesc in cadrul tehnicilor de inginerie genetica, in formarea de hibrizi ADN/ARN etc.

La procariote ADN-ul este in genere monocatenar, circular.

Bacteriile contin in genom ADN. Genomul viral poate fi constituit din molecule de ADN (la adenovirusuri) sau ARN (la ribovirusuri).

Structura secundara a moleculei de ADN

Studiile de cancerogeneza au evidentiat inca de mai multi ani existenta retrovirusurilor (a oncovirusurilor) in celulele maligne. Ele contin in genom ARN; de pe ARN-ul viral se poate sintetiza in celula gazda o molecula de ADN care, se va integra in genomul acesteia sub forma de provirus. Retrovirusurile pot trai in genomul gazdei ani de zile (in forma latenta), transmitandu-se odata cu celula sexuala (ovul sau spermatozoid) de la o generatie la alta.

ADN -Z

Prin folosirea difractiei cu raze X s-a evidentiat existenta in celulele eucariotelor, in unele zone pe cromosomi, a unui ADN bicatenar denumit ADN-Z, care prezinta cateva proprietati diferite de a celui descris mai sus. Astfel, la ADN-Z spiralarea catenelor este spre stanga, pasii unei spirale cuprind cate 12 perechi de nucleotide, iar bazele azotate ale acestora se gasesc spre exterior, fiind deci mai expuse factorilor de mediu (factorilor mutageni) (vezi fig.9).

In celulele umane, ADN-Z se afla in cantitate mica, localizat numai in anumite zone pe cromosomi si anume in zonele fragile "fragile sites" si intotdeauna in vecinatatea oncogenelor. Datorita acestui fapt s-a crezut initial ca ADN-Z ar avea implicatii in procesul oncogen.

In urma mai multor cercetari s-a stabilit insa ca ADN-Z se gaseste in mod normal la om si de asemenea, la alte specii animale, nefiind confirmat un eventual rol jucat in carcinogeneza.

Ceea ce se stie deocamdata despre functia ADN-Z este ca intervine in reglarile genice, recunoscand semnalele pentru sintezele proteice, de asemenea ca ar juca un rol in replicarea ADN-ului.

Unele date sugereaza ca ADN-Z ar avea la om rol inhibitor pentru activitatea genica, in timp ce la procariote ar avea un rol activator.

ADN-ul mitocondrial este o molecula bicatenara, circulara, situata in mitocondrii. Rolul sau genetic nu este pe deplin elucidat. Genele care contin ADN mitocondrial sunt transmise intotdeauna numai pe linie materna. Se estimeaza ca ADN-ul mitocondrial intra in componenta a 13 tipuri de gene structurale si a altor cateva gene care codifica ARN-t.

Fiecare celula umana contine mai multe copii de ADN mitocondrial. Unele mutatii ale acestor gene au fost descrise in cateva boli neuromusculare ereditare si in neuropatia optica (aceste boli sunt transmise doar pe linie materna).

Tipuri de organizare pentru ADN-ul nuclear

Organizarea moleculelor de ADN la eucariote
(structura tertiara)

Organizarea moleculelor de ADN in celule este specifica, fiind diferita la eucariote fata de procariote.

La eucariote ADN-ul este organizat heterogen, existand sub forma a doua tipuri:

ADN nerepetitiv (cu secvente unice), in proportie de 60-70 %;

ADN repetitiv (in mai multe copii), in proportie de aproximativ 30 %, din care aproximativ 10-20% este moderat repetitiv (in sute de copii), iar aproximativ 10% este inalt repetitiv (in zeci sau sute de mii de exemplare).

ADN-ul nerepetitiv este reprezentat de molecule a caror secvente nucleotidice nu se mai gasesc in alte molecule de ADN ale aceleiasi garnituri haploide.

ADN-ul nerepetitiv reprezinta 3/4 din totalul genomului; el intra in constitutia celor aproximativ 50.000-100.000 de gene structurale transcriptibile (cu rol in specificarea de proteine).

In cromosomi, ADN-ul cu secvente unice se gaseste situat in zonele eucromatice (evidentiabile prin tehnici de bandare).

ADN-ul moderat repetitiv cuprinde molecule de ADN a caror secvente se regasesc in multiple exemplare (sute de exemplare in acelasi nucleu). El intra in componenta zonelor necodante din gene, a genelor histogene (care specifica histonele) si a genelor care specifica ARN ribosomal si ARN-uri transportoare.

In cromosomi, ADN-ul moderat repetitiv se afla situat in anumite zone, alternand cu moleculele de ADN nerepetitiv.

ADN moderat repetitiv intervine foarte probabil in reglarile genice.

ADN-ul inalt repetitiv mai poarta denumirea de ADN satelit (a nu se confunda cu zonele satelitilor de la cromosomii acrocentrici). El este format din secvente foarte lungi de nucleotide, repetate de sute de mii de ori in acelasi genom.

In cromosomi este localizat in zonele heterocromatice, mai ales din jurul centromerului si a telomerelor. In genere, in cantitati mai mari se gaseste pe cromosomii 1,9,16, Y.

ADN-ul inalt repetitiv joaca rol in organizarea si pastrarea stabilitatii structurii cromosomilor; prin prezenta sa la nivelul telomerelor si a centromerilor, intervine in buna desfasurare a diviziunilor, joaca rol de schelet si "protector" pentru genele structurale si intervine in procesele de reglari genice.

Moleculele de ADN prezinta multiple infasurari (incolaciri) formand un superhelix pliat, aceasta fiind datorata spatiului restrans din nucleu. In acelasi timp, moleculele de ADN se afla legate de histone si alte proteine nehistonice.

ADN-ul, prin structura sa cu secventializari de nucleotide, codifica informatia ereditara pentru specificarea proteinelor, a unor produsi finali, fiind suportul material al inregistrarii intregii zestre ereditare.

Pentru pastrarea - conservarea- cu fidelitate a mesajului genetic, ADN-ul se dedubleaza intr-un mod propriu, particular, prin proprietatea sa de dedublare -replicare - semiconservativa.

Replicarea ADN-ului

Conservarea fidela a mesajului genetic din ADN in procesul de perpetuare (proliferare) a celulelor are la baza proprietatea moleculelor de ADN de a se replica (dedubla) semiconservativ, incat fiecare catena a ADN-ului va functiona in timpul replicarii ca matrita, incorporandu-se in acelasi timp in cele doua molecule nou sintetizate.

Toate celulele umane care se divid parcurg un ciclu celular compus din patru stadii si anume:

G₁ in care se sintetizeaza enzimele necesare replicarii;

S in care are loc dedublarea ADN;

G₂ in care cromosomii se condenseaza in vederea diviziunii;

M - mitoza insasi.

La sfarsitul interfazei celulare, in faza "S" de sinteza, fiecare celula somatica isi va dubla cantitatea de ADN, acest proces reprezentand pregatirea biochimica a celulei in vederea viitoarei diviziuni; in acest mod, cele doua celule fiice vor primi acelasi material genetic (cantitativ si calitativ) si identic cu cel al celulei mama. Esenta replicarii semiconservative a ADN-ului consta in copierea exacta a secventializarilor nucleotidice, prin asezarea nucleotidelor corespunzatoare conform complementaritatii; acest proces este "supravegheat" de mai multe enzime printre care rol principal il au ADN-polimeraza, exonucleaza si ADN-primaza.

Pentru desfasurarea replicarii, moleculele de ADN sufera o despiralizare prin interventia enzimei helicaza si topoizomeraza, apoi catenele se indeparteaza (se desfac) in mai multe zone deodata, zone denumite "origini" sau "repliconi", incat totalitatea moleculelor de ADN sa se replice in aceeasi faza "S". In dreptul fiecarei catene vor fi asezate conform complementaritatii nucleotide noi, astfel incat in dreptul fiecarei catene vechi se constituie o catena noua.

Selectia nucleotidelor corespunzatoare este coordonata de enzimele mentionate mai sus; urmeaza apoi incatenarea celor doua catene, veche si noua, sub actiunea enzimei ligaza. Desi replicarea ADN-ului are loc in faza "S", exista un usor asincronism in initierea replicarii, astfel, ADN-ul din zonele eucromatice se replica precoce, pe cand ADN-ul din zonele heterocromatice mai tardiv (la sfarsitul fazei "S").

Principiul complementaritatii in sinteza ADN-ului

De altfel si la nivel cromosomial s-a observat ca la cromosomii 4, 8, 13, 21 si unul din cei doi cromosomi X, ADN-ul se replica ceva mai tarziu.

Modelul replicarii semiconservative a ADN-ului a fost demonstrat la nivel molecular si citogenetic folosindu-se izotopi radioactivi (Taylor, 1957).

Procesul replicarii ADN-ului poate fi perturbat, sub actiunea nociva a factorilor mutageni sintetizandu-se portiuni "gresite" (insertii gresite de nucleotide). Asemenea greseli sunt insa reparate (corectate) prin actiunea mai multor tipuri de enzime nucleare si prin care are loc replicarea reparatorie a ADN-ului.

In esenta, repararea se face prin recunoasterea si excizia fragmentului "gresit" de catre endonucleaza, indepartarea acestuia sub interventia exonucleazelor si apoi, prin inserare de nucleotide corespunzatoare, de catre replicaze; in final, va avea loc incatenarea prin interventia ligazei si a ADN-polimerazei.

Desfasurarea procesului de replicare semiconservativa

Rezultatul replicarii semiconservative a moleculei de ADN

Daca fragmentul gresit sintetizat cuprinde mai mult de 25-50 nucleotide este necesara interventia mai multor baterii enzimatice, a altor factori celulari, mecanism cunoscut ca reparare de tip SOS.

Atunci cand enzimele reparatorii sunt in cantitate mica sau slab functionale (prin mutatii ale genelor specificatoare), replicarea se face defectuos, ADN-ul prezentand mai multe leziuni structurale.

Printre cauzele erorilor de replicare si reparare a ADN fac parte factori nocivi chimici din mediu, diversi alti factori mutageni sau, preexistenta unor mutatii genice autosomale; toate acestea determina scaderea sau chiar abolirea sintezei enzimelor necesare procesului de replicare si reparare a ADN-ului.

In patologia umana sunt cunoscute cateva boli monogenice cu transmitere recesiv autosomala, in care prezenta unei asemenea mutatii genice cauzeaza grave perturbari ale repararii ADN-ului, antrenand chiar ample tulburari ale morfologiei cromosomilor si predispozitie crescuta pentru dezvoltarea unui proces canceros. Datorita acestor repercursiuni, bolile respective sunt incadrate ca sindroame cu instabilitate cromosomica. Din acest grup fac parte: pancitopenia Fanconi (anemia Fanconi), ataxia-telangiectazia, sindromul Bloom, xeroderma pigmentara s.a.

Unele cercetari recente privitoare la capacitatea celulei de reparare a ADN-ului releva rolul pe care il joaca proteina supresoare de tumora (proteina p53) in reglarea ciclului celular si cresterea celulara. Astfel, s-a evidentiat ca in cazul in care ADN-ul celular a suferit modificari secventiale, celula va fi blocata in stadiul G₁al ciclului celular sub actiunea proteinei p53 pana la terminarea procesului repararii. Daca insa celulele prezinta mutatia genei pentru proteina p53, procesul repararii este defectuos, sau stopat si celulele se transforma rapid in celule canceroase.

Din cele de mai sus rezulta ca exactitatea replicarii ADN-ului si a repararii greselilor secventiale joaca rol covarsitor in pastrarea informatiei ereditare, a echilibrului ciclului celular si a cresterii celulare.

Pentru buna desfasurare a acestor procese concura mai multe enzime a caror functionalitate este deosebit de importanta in corectarea eventualelor greseli secventiale survenite sub actiunea factorilor mutageni.

Notiunea de gena

Continutul notiunii de gena a evoluat in paralel cu acumularea si aprofundarea datelor despre ereditate. Termenul de gena a fost introdus de catre Johannsen in 1909, socotind gena ca pe un echivalent al factorilor mendelieni.

In aceeasi perioada de timp, Boveri si Sutton (independent unul de altul) elaborau ipoteza amplasarii genelor pe cromosomi.

In deceniile II si III ale secolului XX, rezultatele cercetarilor lui Morgan, efectuate pe Drosophila, au condus la elaborarea teoriei cromosomiale a ereditatii.

Marea majoritate a cercetarilor scolii morganiste au fost efectuate pe Drosophila datorita multiplelor avantaje pe care le ofera: numar redus de cromosomi, prezenta in unele tesuturi a cromosomilor uriasi cu structura usor identificabila; la fel, inmultirea rapida a insectei, astfel incat intr-un timp scurt pot fi examinate mai multe generatii succesive, fiind facila urmarirea transmiterii caracterelor la descendenti.

Toate aceste cercetari, cu realizare de mutatii si hibrizi intre diferite forme mutante, au condus la conturarea principiilor teoriei cromosomiale ale ereditatii.

Conform acestei teorii s-au stabilit urmatoarele:

numarul de cromosomi este specific fiecarei specii;

celulele somatice sunt diploide continand perechi de cromosomi (omologi); pe acestia se gasesc amplasate gene alele;

in meioza, cromosomii omologi se separa (celulele sexuale sunt deci haploide);

gena ar fi unitate indivizibila, reprezentand unitatea de structura si functionalitate, enuntandu-se expresia simbolica: "o gena = un caracter";

gena ar ocupa pe cromosomi un loc fix (locus), avand asezare liniara una sub alta si relatii de vecinatate cu genele adiacente (fenomenul de linkage);

gena ar fi unitatea de mutatie, astfel ca sub actiunea factorilor mutageni pot apare alele mutante cu expresivitate variabila fenotipic (alelie multipla);

gena ar fi unitatea de recombinare genetica in timpul meiozei.

In 1957, cercetarile lui Benzer modifica conceptia clasica despre gena, demonstrand ca gena este formata din multiple subunitati reprezentate de nucleotide. In acelasi timp s-a stabilit ca o parte din gene sunt structurale, codificand mesaje pentru specificarea de proteine, iar altele sunt gene de control (operatoare si reglatoare), cu rol coordonator asupra genelor structurale. In paralel, s-a mai stabilit ca cea mai mica unitate din gena care poate suferi mutatie este un nucleotid (un muton) si ca unitatea de recombinare genetica in timpul meiozei este reconul. Pe parcursul aceleiasi perioade de timp, odata cu acumularea cunostintelor despre ereditatea poligenica si despre pleiotropism, principiul " o gena = un caracter" a suferit ample schimbari in continut. Astfel, este unanim acceptat ca in expresia unui caracter poligenic se implica un numar variabil de gene. In contrast cu aceasta, unele gene au efect pleiotrop. Prin pleiotropism se intelege mecanismul prin care o gena se interfereaza in constituirea mai multor caractere pe diferite organe si aparate.

Pe baza cercetarilor moderne de genetica moleculara, notiunea de gena a fost reformulata; astfel, in conceptul actual gena este definita ca un fragment de ADN nuclear, mitocondrial sau ARN (pentru ribovirusuri), de lungime diferita si care contine un mesaj codificat pentru sinteza unui produs specific.

Studiile de genetica moleculara au demonstrat de mai multi ani ca in genomul uman exista - cel putin pentru unele tipuri de gene structurale - cateva gene inactive cu aceleasi secvente nucleotidice, denumite pseudogene. Pseudogenele sunt gene complet reprimate; se presupune ca pseudogenele au fost scoase din functie pe parcursul evolutiei filogenetice, ramanand in genom ca niste vestigii; alta ipoteza vehiculeaza supozitia originii pseudogenelor prin duplicatie de-a lungul filogeniei.

In paralel, s-a mai demonstrat existenta in populatie, pentru un acelasi locus, a mai multor forme alternative de alele (alelie multipla), fiecare avand un mod propriu de exprimare in fenotip.

Alelia multipla (polimorfismul alelic) este frecvent intalnita in populatia generala atat la gene normale cat si la gene patologice.

Exemple clasice de polimorfism alelic sunt genele pentru grupele sanguine ABO si genele pentru sistemul HLA; polimorfismul alelic este insa foarte bine reprezentat in populatie in multiple alte locusuri.

Aparitia aleliei multiple este consecinta diferitelor tipuri de mutatii ce au survenit de-a lungul timpurilor; existenta ei asigura - pe langa alte mecanisme - un grad de variabilitate indivizilor unei populatii si in anumite situatii o mai buna adaptabilitate la mediu. Cat priveste genele patologice, alelia multipla determina variatii ale tabloului clinic in cadrul aceluiasi tip de boala.

Genele sunt amplasate in locusuri intr-o inlantuire de-a lungul cromosomilor. Genele apropiate intre ele au relatii de vecinatate, astfel ca in functie de inlantuirea - de legaturile stranse - dintre ele, unele se vor transfera in bloc (in grup) in timpul recombinarilor genetice din meioza; procesul este cunoscut sub numele de linkaj genic.

Structura genei si mecanismele expresiei genice

La eucariote gena are structura complexa, neomogena, continand zone codante si translabile denumite exoni alternand cu zone netranslabile numite introni.

Exonii sunt regiuni din gena formate din secvente nucleotidice de pe a caror insiruire se va sintetiza (prin transcriptie) un fragment de ARN mesager (ARN-m) primar. Ele sunt fragmente codificante si active pentru specificarea de proteine. Din punct de vedere molecular, gena poate fi definita ca structura secventiala de nucleotide necesare pentru producerea unei molecule de ARNm, respectiv a unei unitati de transcriptie.

Intronii sunt fragmente din gena care participa ca si exonii la transcriptie, dar ARNm sintetizat de pe introni este intotdeauna excizat in timpul asamblarii ARN-ului mesager matur, deci intronii nu participa la translatia mesajului; ei sunt regiuni netranslabile.

Conform celor expuse mai sus, ARNm matur se constituie doar prin asamblarea fragmentelor sintetizate de pe exoni.

Una din principalele functii ale intronilor este de a interveni, prin intermediul fragmentelor de ARN sintetizate, in initierea sintezelor proteice. Eventuale mutatii ale intronilor pot perturba procesul asamblarii moleculei de ARN-m matur, implicandu-se astfel in producerea unor boli genice.

Alaturi de exoni si introni, de-a lungul genei se afla esalonate elemente reglatorii, care coordoneaza procesul transcriptiei, respectiv expresia genei.

La unul din capete, gena detine o regiune denumita promotor, constituita din sute de nucleotide, cu rol in initierea transcriptiei. In fapt, promotorul serveste la legarea la acel nivel a enzimelor ARN-polimeraze, a caror interventie este necesara pentru procesul transcriptiei. Eventuale mutatii intervenite in promotor pot scade, sau chiar impiedica functionalitatea genei.

Structura genei la eucariote; transcriptia, translatia

La procariote gena este compusa din secvente nucleotidice codificante, continue, liniare si la care transferul de mesaj pentru sinteza proteinelor se face conform colinearitatii. Colinearitatea se refera la relatia paralela dintre secventele nucleotidice din ADN-ul unei gene (respectiv cele din ARN mesager copiat) si aminoacizii dintr-un polipeptid.

Cercetarile de genetica moleculara au evidentiat la procariote existenta in gene a unor portiuni mobile, saltante, denumite transpozoni care isi pot schimba locul, inserandu-se in alte locusuri si schimband in acest mod mesajul din gena.

In genomul uman, aproximativ 1/5 din totalul genelor sunt gene care specifica proteinele necesare transportului membranal si pentru generare de energie; aceste gene sunt cunoscute ca gene housekeeping si sunt localizate in regiunile ADN-ului bogat in nucleotide C G. Celelalte 4/5 din genele genomului se afla in regiunile ADN mai bogate in A = T si sunt functionale in mod specific fiecarui tesut.

In genom, o parte din gene, desi se afla plasate pe cromosomi diferiti, au origine comuna si concura in expresia unui aceluiasi caracter. Ele sunt numite familii de gene. Desi semnificatia dispersiei lor nu este pe deplin cunoscuta, se estimeaza ca acest fenomen ar fi consecinta prefacerilor genomice ce au avut loc pe parcursul evolutiei filogenetice.

Dintre familiile de gene din genomul uman fac parte: genele pentru globinele din hemoglobina, genele pentru imunoglobuline, genele pentru colagen, genele pentru vizibilitatea cromatica s.a.

Din cele expuse mai sus se releva ca expresia genica este coordonata la nivel molecular de interventia mai multor structuri si mecanisme. Procesul transcriptiei genice este puternic conditionat de: buna functionare a promotorului, elementele reglatorii din gena, regiunile netranslabile (introni), respectiv de capacitatea de excizie a fragmentelor de ARNm si de care apoi depinde asamblarea ARNm matur si, desigur si de integritatea structurala a exonilor.

In afara de acestea, expresia genica este dependenta si de alte mecanisme, intre care un loc aparte il reprezinta amprenta genomica, fenomen bine cunoscut -cel putin - la unele gene patologice.

Prin amprenta genomica se intelege mecanismul prin care o gena din perechea alelica se exprima diferit fenotipic, in functie de provenienta sa materna sau paterna.

Astfel, in unele boli genice, severitatea expresiei genice, respectiv severitatea tabloului clinic sunt diferite in raport de originea genei, materna sau paterna. Asa de exemplu, in neurofibromatoza si in distrofia miotonica (boli monogenice), gena patologica mostenita pe linie materna determina un debut mai precoce si o evolutie mai severa a bolii.

In contrast, in boala Huntington si in ataxie-telangiectazie (de asemenea boli monogenice), gena patologica mostenita pe linie materna are o expresie fenotipica mai redusa decat cea mostenita patern.

Amprenta genomica este remarcata si in unele sindroame cu mutatii ale catorva gene invecinate si care se insotesc sau nu de fine modificari structurale ale cromosomului la acel nivel (microdeletii, microduplicatii). In aceste sindroame, amprenta genomica se exprima puternic astfel incat, in functie de provenienta, mutatiile genice vor antrena simptomatologie diferita.

Exemple elocvente sunt sindroamele Prader Willi si Angelman.

In sindromul Prader-Willi, mutatia genica (posibil mutatii ale catorva gene alaturate situate pe cromosomul 15) antreneaza in tabloul clinic disgenezie gonadica, hipotonie musculara, dismorfii somatice s.a. In schimb, in sindromul Angelman, mutatii din aceeasi regiune cromosomica mostenite pe linie materna, determina tablou clinic diferit, in care prevaleaza tulburari neurologice.

Fenomenul amprentei genomice se transmite in generatii conform modelului mendelian. El a fost identificat la mai multe gene patologice situate pe cromosomii 7, 11, 14, 15.

Cunoasterea in intimitate a amprentei genomice urmeaza a fi elucidata prin continuarea cercetarilor de genetica moleculara.