Fertilizarea in vitro si transferul de embrioni

I. Introducere

1. Importanta transferului de embrioni

Transferul de embrioni este o metoda biotehnica moderna de reproducere artificiala, care consta in recoltarea embrionilor, aflati in diferite stadii de dezvoltare, de la animale cu performante deosebite sunt transferati la animale mai putin valoroase, care devin mame adoptive. Acestea asigura cresterea si dezvoltarea embrionului pana la fatare. De aceea, transferul de embrioni presupune obligatoriu "un cuplu" - DONATOR - RECEPTOR.

In ciuda frecventelor afirmatii care sustin ca transferul de embrioni face parte din grupa biotehnologiilor moderne, momentul aparitiei s-a nascut la finele secolului trecut si evolutia sa a urmat un curs ascendent care se concretizeaza si acum, pe tot mapamondul. Acestea sunt premisele in virtutea carora transferul de embrioni si biotehnologiile sale conexe reprezinta o componenta majora in contextul cresterii si diversificarii permanente a productiilor de origine animala.

Prima generatie de biothenologii prin insamantarea artificiala cu material seminal congelat a permis o difuzare rapida a procesului genetic pe linie paterna. In acelasi mod, obtinerea prin transfer de embrioni a unui numar sporit de descendenti de la femelele de mare valoare genetica, mareste difuzarea progresului genetic pe calea descendentei femelei. Deci, prin aceasta medota se restabileste egalitatea in ceea ce priveste aportul masculilor si femelelor la ameliorarea efectivelor de animale. Transferul de embrioni este o metoda capabila sa salveze efectivele de animale neutilizate la reproductie datorita aptitudinilor zootehnice scazute sau din diferite motivatii economice. Posibilitatea multiplicarii descendentei femelelor de mare valoare economica deschide posibilitatea extinderii transferului de embrioni, care sa foloseasca in scop comercial embrioni proaspeti sau congelati. Comercializarea embrionilor constituie un produs concurential pentru dezvoltarea schimburilor de material genetic, ca o modalitate sigura si garantata a starii sanitar-veterinare.

Prezinta importanta din punct de vedere zootehnic, economic, sanitar-veterinar si stiintific.

2. Istoricul activitatii

Primele lucrari ce confirma aparitia transferului de embrioni, dateaza din anul 1891, cand un economist reconvertit in biolog, Walter Heape, a prezentat prima lucrare cu aceasta tema, in Marea Britanie. Acesta, in urma unor experimente derulate pe iepuri, a reusit obtinerea primilor produsi vialibi ca urmare a unui transfer chirurgical al embrionilor. Heape nu a urmarit atat transferul in sine ci, demostrarea efectelor induse de catre uterul unei femele receptoare asupra unor embrioni straini. Comunitatea stiintifica britanica a acelor timpuri a negat cu vehementa valoarea teoretica si practica a descoperirilor lui Heape. Au fost necesari 15 ani pentru ca cineva sa reconsidere munca de pionierat a lui Heape. Acel cineva a fost, Biedl, un embriolog ceh, care a repetat experimentele lui Heape, in 1913, insa a confirmat viabilitatea experimentelor lui Heape abia in 1921, in lucrarea sa.

In lucrarea sa, in 1933, Nicholas, un eminent embriolog, reia experimentele de transfer embrionar la animalele de laborator, subliniind importanta sincronizarii dintre ciclul estral al donatoarelor si cel al receptoarelor, si chiar al primelor incercari de micromanipulare embrionara, respectiv separarea si cultivarea separata a blastomerelor embrionare.

Primele lucrari privind recuperarea embrionilor din tractul genital de oaie s-au efectuat pe oi sacrificate de Warwick in 1934 si 1939. Ulterior, Lopirin in 1950-1951 a obtinut 9 miei dupa transferul embrionilor de 4-6 zile.

Pe langa interesul pur stiintific pe care il prezenta transferul de embrioni, acesta a avut ti un rol aparte, la evaluarea oportunitatilor practice, aplicative, comerciale, pe care aceasta biotehnologie le putea oferi crescatorilor de animale. Dupa anii 1980, cercetarile in acest domeniu au luat o mare amploare, in special la taurine. In Romania, primele lucrari au fost efectuate de catre Otel si Federean, pe oi, in 1966-1967.

3. Perspective

In prezent, cercetarile in domeniul transferului de embrioni s-au extins la mai multe specii de animale, in multe tari ale lumii.

Astfel, in 1974, in SUA s-a infiintat "International Embryo-Transfer Society", care cuprinde specialisti in domeniul transferului de embrioni la specia umana si la animale. Si in Europa, in 1982, s-a constituit "L'Association Europene de Transplantation Embrionaire".

In paralel cu imbunatatirea tehnicilor de colectare si conservare a embrionilor s-au realizat echipamente complexe fara de care progresul in acest domeniu nu ar fi fost posibil. Printre acestea, cele mai importante sunt hotele sterile performante, sub care se efecuteaza manipularile de embrioni, incubatoarele cu atmosfera controlata si congelatoarele pentru embrioni, care realizeaza racirea cu azot sau aer, echipamentele complexe pentru colectare si transfer. De asemenea, au fost optimizate mediile de colectare si cultura, precum si acelea de congelare. Ca urmare, rezultatele obtinute in biotehnicile transferului de embrioni s-au imbunatatit an de an, obtinanu-se rate mari de gestatie la toate speciile, dupa transferul de embrioni proaspeti sau congelati.

In Romania, cercetarile s-au extins initial in mai multe centre, scopul final fiind aplicarea acestei tehnici in ferme si gospodarii private in scopul ameliorarii efectivelor crescute in ferme de elita sau in multiplicarea rapida a efectivelor importante reduse numeric. Aceste lucrari de transfer de embrioni, s-au facut in centre precum IBNA Balotesti, la ICPCOC Palas Constanta, la SC Romsuintest SA Peris, la USAMV Cluj-Napoca, si continua.

Reusita transferului de embrioni este conditionata de sincronia in evolutie a aparatelor genitale ale femelelor donatoare si receptoare, astfel ca, embrionul transferat, trebuie sa gaseasca in aparatul genital al receptoarei, aceleasi conditii fiziologice de mediu, in care s-a aflat in momentul colectarii. Astfel, se realizeaza legaturile cu mama adoptiva, prin care se continua dezvoltarea embrionului in cursul gestatiei pana la fatare.

II. Aparatele genitale mascul si femel la ovine - anatomie, roluri, componente

Anatomia aparatului genital mascul

Aparatul genital mascul este alcatuit din:

a) Organe esentiale - testiculele

b) Cai spermatice: epididim, canal deferent, canal ejaculator, uretra

c) Organul copulator - penisul

d) Glandele anexe: prostata, glandele bulbo-uretrale, veziculele seminale.

Rolul aparatului genital mascul este acela de a participa impreuna cu aparatul genital femel la perpetuarea speciei. Pentru aceasta, aparatul genital mascul indeplineste mai multe functii specifice:

Rol gametogen - produce gameti sexuali masculi, care se realizeaza la nivelul tubilor seminiferi

Rol hormonal - produce hormoni androgeni secretati de glanda interstitiala a testiculului (glanda lui Leydig) si hormonul X (inhibina).

Depunerea spermei in organele genitale femele.

Testiculele sunt formatiuni ovoide, ce sufera un proces de migratie, in urma caruia strabat traiectul inghinal, stabilindu-se in afara cavitatii abdominale, de o parte si de alta a penisului, formand bursele testiculare. Testiculele ajung la nivelul jaretelor, iar cordonul testicular este foarte lung.

Bursele testiculare sunt dispuse in regiunea inghinala, si sunt formate din suprapunerea a 6 invelitori: scrotum, dartos, celuloasa fibroasa, seroasa si cremaster. Scrotumulul este depigmentat, iar productia piloasa este abundenta.

Extremitatea superioara a testiculelor este integral acoperita de capul epididimului, care se prelungeste pe jumatate din lungimea marginii libere, iar extremitatea inferioara adera intim la coada epididimului. Parenchimul testicular este format din tubi seminiferi, unde are loc spermatogeneza. Tesutul intertubular contine celule Leydig care secreta testosteron.

Tubii seminiferi au in medie 0,2mm diametru, au o lungime totala de 150-700 mm si sunt compusi din celulele liniei spermatogenetice (celule germinale care se vor transforma in spematozoizi) si de celule de sustinere (celule Steroli) care hranesc celulele germinale. Celulele Leydig au o structura tipica celulelor care produc steroizi. Acestea produc testosteron, sub controlul direct al LH-ului hipofizar.

Epididimul este foarte dezvoltat, avand o lungime de 70-75 m si acopera complet marginea posterioara si extremitatile gonadei.

Penisul este lung de 0,6-0,9 m, prezentand unele particularitati ale extremitatii libere. Glandul este foarte dezvoltat, conic avand aspectul unui capison care acopera extremitatea craniala a corpului cavernos. Uretra extrapelvina prezinta un S penien, ampule ale canalelor deferente.

Mucoasa uretrala se prelungeste inaintea glandului, formand un apendice vermiform lung de 3-4 cm.

Caile genitale mascule sunt dotate cu un sistem glandular extraparietal moderat dezvoltate, al caror produs de secretie contribuie la elaboararea spermei. Aceste glande sunt reprezentate de glande seminale, prostata si glanda bulbo-uretrala.

La fiecare ejaculat volumul secretiilor este in medie de 0,5-1,2 ml.

Anatomia aparatului genital femel

Aparatul genital femel este alcatuit din:

a) Organe esentiale - ovarele

b) Cai genitale - interne: oviducte, uter(coarne, corp, cervix), vagin, vestibul

- externe: vulva, clitorisul

Rolul fundamental al aparatului genital femel este acela de a participa impreuna cu aparatul genital mascul la perpetuarea speciei. Pentru aceasta, aparatul genital femel indeplineste mai multe functii specifice:

Rol gametogen - elaborarea ovulelor

Rol hormonal - secretia de hormoni (estrogeni, gestageni, placentari si tisulari)

Asigura conditii optime pentru fecundatie, nidatie, gestatie si parturitie.

La femele tinere si negestante aparatul genital este situat in totalitate, in cavitatea pelvina, pe planseul bazinului.

La femelele varstnice sau la cele gestante, se produce o modificare a topografiei, si anume, ovarele, oviductele si coarnele uterine, coboara in cavitatea abdominala.

Ovarele sunt formatiuni bipare, cu forma ovoida, usor aplatizata, avand o lungime de 1,5-2cm si o greutate de 1-2,5 g. Dupa pubertate suprafata lor este neregulata.

Oviductele au o lungime de 10-30 cm, se compun din trei parti: pavilion, ampula si istm, fiind mai largi catre extremitatea posterioara, trecerea la coarnele uterine facandu-se pe neobservate.

Uterul este de tip bipartit, prezinta spre lumen intre 88-96 carunculi, care au o suprafata concava. Coarnele uterine au dimensiuni de pina la 10-12cm, comparativ cu corpul uterin care este scurt de 2-3 cm si se termina in partea caudala cu cervixul. Cervixul este un organ de sine statator, care indeplineste functiile de reproducere, gestatie si sexuala. Lumenul cervixului este usor curbat sub forma literei S. Acesta se deschide in vagin prin ostiumul vaginal si prezinta o floare involta simpla, formata din doua falduri ale mucoasei cervicale, cel superior fiind mai mare, si acopera ostiumul vaginal al cervixului, asemanandu-se cu un cioc de papagal.

Vaginul si vestibulul vaginal sunt conducte musculo-membranoase, ce au rol in actul imperecherii, permitand introdicerea penisului in vagin.

Acestea nu prezinta glande vestibulare majore si minore (glandele lui Bartholini) si nici formatiunile tubulare din peretii vestibulului vaginal - canalele lui Grtner.

Vulva este un organ carnos format din doua labii vulvare asezate in forma triunghiulara cu varful in jos. La comisura inferioara, putin spre exterior se gaseste clitorisul, care este mic si cu varful incurbat, fara smoc de peri.

III. Ciclul sexual

Modificarile morfo-fiziologice si comportamentul oilor pe parcursul ciclului sexual depind de zona de crestere si de tipul morfo-productiv. Oile fac parte din grupa femelelor poliestrice sezoniere. Astfel, la majoritatea raselor de oi cresute in zona temperata, caldurile apar in sezonul de toamna, incepand cu luna august si se manifesta pina in luna octombrie - noiembrie. La rasele de oi crescute in zona tropicala sau cele de carne din Anglia, estrusul poate apare in tot timpul anului.

Aspectul sezonier al ciclului sexual la oaie se datoreaza influentei deosebite a raportului dintre durata zilei si a noptii (lumina/intuneric) asupra sistemului hipotalamo-hipofizar, cel mai favorabil fiind cel de toamna. Aceasta este perioada in care oile pot fi montate sau insamantate artificial pentru a ramane gestante, putand vorbi deci de un sezon de monta.

Aparatul genital femel desfasoara o activitate ciclica de la aparitia maturitatii sexuale pana la climacterium, periodic se creeaza conditii pentru fecundare si dezvoltarea embrionului. Durata ciclului sexual este mai scurta decat la toate celelalte specii domestice, fiind in medie de 15 - 17 zile, cu variatii cuprinse intre 14 - 20 zile.

Aceste procese complexe ale reproducerii sunt coordonate si dirijate in mod armonios de sistemul neuro-endocrin.

Ciclul sexual cuprinde urmatoarele stadii:

Proestru (3 zile) - pe un ovar sau chiar pe ambele ovare se constata prezenta a 1-2 foliculi ovarieni mariti si corpi galbeni involutivi de la caldurile anterioare. Uterul este puternic heperemiat, iar cervixul se pregateste pentru secretia de mucus. In frotiul vaginal apar celule epiteliale descuamate si leucocite.

Estru (1-2 zile) - pe ovar proemina 1-2 foliculi maturi, iar in a doua zi se produce ovulatia. Uterul este congestionat, iar peretii sai sunt tapetati de o secretie sticloasa. Cervixul se intredeschide pentru putin timp spre sfarsitul caldurilor, secretia de mucus de calduri atinge maximum, eliminandu-se pe la comisura inferioara a vulvei. pH-ul acestei secretii este usor acid sau neutru, favorizand fecundatia. Alaturi de aceste modificari ce pot fi puse in evidenta prin examen ginecologic, se constata si un comportament caracteristic al femelei in calduri. Oaia aflata in stadiu de estrus behaie mai mult ca de obicei si mai ales in apropierea masculului, are un apetit capricios sau scazut, se apropie de mascul si se lasa abordata si montata de acesta. De multe ori semnele caracteristice de calduri sunt sterse si de aceea este necesara descoperirea acestora cu ajutorul berbecilor incercatori.

Metestru (10 zile) - oaia devine complet linistita. Pe ovar se formeaza si se dezvolta corpul galben ciclic, ce poate fi observat la circa 3 zile de la ovulatie, ca o formatiune sferica, gelatinoasa, treptat creste in dimensiuni, isi modifica culoarea si consistenta, ajungand la dezvoltarea maxima la 11 zile de la ovulatie, cand are forma si marimea unui sambure de cireasa si este foarte elastic. La inceputul acestui stadiu celulele epiteliale au nucleii rotunzi, situati bazal, apoi devin ovali si se deplaseaza spre polii celulelor, ceea ce demonstreaza inceputul activitatii secretorii. Glandele uterine isi maresc lumenul si creste cantitatea de embriotrof, scade starea de edem de calduri a uterului si apar puternice infiltratii leucocitare. Cervixul este inchis.

Diestru (2 zile) - corpul galben ciclic, daca fecundatia nu a avut loc, se inconjoara de o albuginee consistenta de culoare gri, regreseaza treptat intr-o perioada echivalenta cu durata a 2-3 cicluri de calduri. Celelalte segmenete ale aparatului genital sunt nemodificate.

Durata si timpul de aparitie a caldurilor sunt determinate de influenta a trei factori importanti, si anume:

Factori externi - alimentatia, sistemul de intretinere si exploatare, miscare, clima, excitatiile din mediu extern.

Factori interni - sistemul nervos, sistemul endocrin, organele genitale.

Receptivitatea aparatului genital femel aflat sub dependenta hormonala.

IV. Tehnologia transferului de embrioni la oaie

Din punct de vedere stiintific transferul de embrioni a fost si ramane in continuare, o metoda eficienta si valoroasa pentru studierea proceselor legate de fecunditatea, determinarea influentei materne si paterne asupra produsului de conceptie studierea dezvoltarii embrionare, a stabilirii cauzelor care determina abateri de la dezvoltarea normala ca si a factorilor care genereaza mortalitatea embrionara.

Produsii obtinuti prin transfer de embrioni ofera posibilitatea studierii influentei factorilor genetici si de alimentatie asupra lor si asupra ereditatii unor markeri genetici.

Principalele aplicatii de natura zoo-economica a transferului de embrioni ar fi:

a.       Cresterea numarului de produsi de conceptie obtinuti de la femelele deosebit de valoroase din punct de vedere al productiilor zootehnice;

b. Obtinerea de produsi de la femelele valoroase economic dar care, din diferite motive, au dobandit o stare de infertilitate care nu le permite reproducerea pe cale fiziologica, naturala;

c.       Simplificarea operatiunilor de import/export a animalelor;

d. Accelerarea semnificativa a procesului de selectie/ameliorare a efectivelor de animale;

e.       Depistarea eficienta a unor maladii ereditare;

f.        Introducerea de gene noi in populatiile inchise din punct de vedere reproductiv;

g. Cresterea numarului de indivizi din populatia matca in cazul unor specii sau rase reduse numeric sau aflate pe cale de disparitie.

In Romania cercetarile s-au extins initial in mai multe centre, scopul final fiind aplicarea acestei tehnici in ferme si gospodarii private in scopul ameliorarii efectivelor crescute in ferme de elita sau pur si simplu, in multiplicarea rapida a efectivelor importante reduse numeric.

Ameliorarea rapida a efectivelor de ovine este limitata de numarul redus de produsi ce se obtin de la o femela in cursul vietii sexuale si de intervalul relativ mare intre generatii. Prin aplicarea transferului de embrioni, acesti factori vor fi eliminati. Animalele care prezinta valoare zoo-economica sunt supuse programelor de ovulatie multipla si transfer de embrioni, in consecinta acestea vor contribui la cresterea de 8 - 10 ori a numarului de produsi, iar presiunea de selectie va creste prin utilizarea intensiva a mamelor de berbeci.

Conservarea embrionilor a lunga perioada de timp in azot lichid a deschis mari perspective importului de material genetic conservat. Acesta condice la scaderea costurilor, ca urmare a reducerii costurilor de transport, eliminarea perioadei de carantina si a restrictiilor sanitar-veterinare, ce se impunea animalelor vii.

Din punct de vedere tehnic realizarea transferului de embrioni se efectueaza printr-o succesiune de etape, care in ordinea efectuarii lor sunt:

alegerea donatoarelor si receptoarelor;

provocarea poliovulatiei la femelele donatoare;

recoltarea embrionilor, controlul calitatii lor si transferul;

conservarea embrionilor;

transferul propriu-zis de embrioni la femelele receptoare;

ingrijirile femelelor donatoare si receptoare dupa transfer;

Biotehnica transferului de embrioni presupune existenta obligatorie a unui cuplu, donator - receptor. Pentru formarea acestor cupluri trebuie sa se aiba in vedere unele criterii si anume: superioritatea genetica a femelelor donatoare, aptitudini de reproducere normala si valoare economica recunoscuta. Rolul femelelor receptoare la ovine consta in sustinerea dezvoltarii embrionilor transferati pe durata fiziologica a gestatiei.

Reusita transferului de embrioni este conditionata de sincronia in evolutie a aparatelor genitale ale femelelor donatoare si receptoare, astfel ca, embrionul transferat, trebuie sa gaseasca in aparatul genital al receptoarei, aceleasi conditii fiziologice de mediu, in care s-a aflat in momentul colectarii.

Astfel se realizeaza legaturile cu mama adoptiva, prin care se continua dezvoltarea embrionului in cursul gestatiei pana la fatare.

Cel mai simplu procedeu este urmarirea in lotul de animale alese ca receptoare a femelelor care prezinta estrul in aceeasi zi spontan cu donatoarele. Aceasta metoda este foarte eficace, din punctul de vedere al rezultatelor transferului embrionar, prin aceea ca se actioneaza pe organisme care manifesta natural ciclul estral.

Singurul dezavantaj este acela ca, este nevoie de un numar mai mare de oi receptoare in asteptare, cu care se cheltuiesc bani si materiale pentru intretinere si furajare, ceea ce conduce la cresterea considerabila a pretului de cost a embrionilor produsi. De aceea, pentru obtinerea de femele receptoare se realizeaza tratamente pe cale medicamentoasa, sincronizand estrul cu acela al donatoarelor.

Realizarea superovulatiilor la oile donatoare, colectarea embrionilor si transferul lor la receptoare formeaza un ansamblu de activitati, denumite generic MOET (multiple ovulation and embryo transfer), constituind o metoda de reproducere asistata si de crestere a animalelor. Scopul MOET este realizarea de produse de calitate superioara. Intre acestea, se numara atat produsii cat si sperma sau embrionii destinati pentru comercializare. Costul este insa foarte ridicat, variind de la 100 EU pana la 1.200 EU per embrion. In unele tari, la toate speciile animalelor de ferma, MOET se aplica in scopul reducerii intervalului intre generatii.

Potentialul de utilizare a transferului de embrioni dupa ovulatie multipla MOET pentru programele de selectie a fost estimat pentru diferite specii. Astfel, in 1986 Smith a elaborat programe MOET pentru oi.

Aprecierea corecta a metodei MOET se face prin evaluarea progresului genetic adus in cresterea animalelor si nu numai prin aprecierea performantelor tehnice imediate (rata de gestatie, fecunditate, prolificitate, supravietuire de embrioni). Rezultatele acestui program, care a folosit metoda MOET, au fost prezentate la conferinta Societatii Britanice a Crescatorilor de Animale in anul 1983.

Ca urmare, s-a scurtat intervalul intre generatii, dar au fost influentati pozitiv si alti factori. Aceasta metoda a trecut din stadiu de cercetare intr-o metoda practica utilizata pentru sporirea productiei de miei.

Cercetatorii Smith si Nicholas in 1980 au recunoscut greutatile aparute la superovulatie, insa metodele s-au imbunatatit pe parcurs. In primul rand, congelarea embrionilor a devenit o tehnica foarte dezvoltata, iar rata de conceptie care se obtine dupa transferul de embrioni este de aproximativ 60% atat in cazul utitlizarii embrionilor proaspeti, cat si a celor congelati.

Programul Nicholas - Smith are la baza aprecierea valorii de ameliorare a masculilor in functie de valoarea productiilor surorilor si semisurorilor comparata cu a fiicelor lor. In medie pe an, programul trebuie sa produca surori si frati adevarati, cate 24 - 26 la ovine. Aceste animale vor constitui turmele nucleu de multiplicare prin transfer de embrioni, care dupa 2 - 3 ani, 50% din numarul lor va cuprinde grupa de fiice obtinute prin transfer de embrioni de la cele mai bune animale, care vor fi supuse controlului productiilor.

La ovine tehnologia de reproducere MOET se poate utiliza pentru cresterea ratei de ovulatie a nucleelor de elita. Cu toate acestea, succesele programelor MOET aplicate la oi au fost mai mici decat la taurine. Costul MOET la ovine este mai mare fiind determinat de valorile individuale ale animalelor care pot sa depaseasca beneficiile rezultate din sporul genetic obtinut. Se aplica si in prezent la oile specializate pentru productiile de carne si lapte.

Alegerea donatoarelor si receptoarelor

Donatoarele si receptoarele trebuie sa satisfaca unele cerinte sanitar-veterinare de care depinde reusita operatiilor.

Alegerea femelelor donatoare se realizeaza pe baza urmatoarelor criterii:

statusul de reproductie al efectivului din care provin

dezvoltarea corporala

rasa, varsta, originea

modul de comportament la reproductie

desfasurarea fatarii si alaptarii

productia de lapte si de lana

rezistenta la boli

Un criteriu obligatoriu il reprezinta valoarea progesteronemiei, stabilita in perioada ciclului de control dinaintea poliovulatiei. O problema care ramane deschisa este aceea a reutilizarii donatoarelor, ceea ce impune masuri deosebite de evitate a imbolnavirilor in timpul operetiunilor de sincronizare a estrului si a recoltarii embrionilor.

Alegerea receptoarelor este o operatiune complexa desi aparent ar fi mai usor de realizat decat alegerea donatoarelor. Unul dintre criteriile alegerii receptoarelor de embrioni il reprezinta varsta, preferat fiind tineretul femel si primipare, la care frecventa infectiilor genitale postpartum este mai redusa, traumatismele postpartumsunt mai rare, iar raspunsul la tratamentele de sincronizare a estrului este mai bun. De asemenea, se are in vedere dezvoltarea corporala si statusul nutritional, deoarece eventualele deficiente de natura alimentara pot determina hipofunctii ovariene care compromit actiunea de transfer. Se tine seama si de modul de manifestare a caldurilor pe parcursul mai multor cicluri estrale.

Fie ca sincronizarea receptoarelor cu donatoarea se face pe cale naturala, fie prin tratament hormonal, depistarea caldurilor la receptoare este foarte importanta si determina eliminarea din lot a celor care nu sunt bine sincronizate cu donatoarea.

Provocarea poliovulatiei la femelele donatoare

Provocarea poliovulatiei este necesara pentru a spori numarul total de embrioni recoltati si respectiv de embrioni transferabili. Raspunsul la diferite tratamente aplicate depinde de variabilitatea produselor hormonale utilizate, ca si de receptivitatea individuala.

La ovine pentru inducerea poliovulatiei se folosesc:

gonadotropine obtinute din serul de iapa gestanta (PMSG)

extracte hipofizare de porc (FSH)

diverse preparate asociate (Gn-RH)

produse comerciale contaminate cu FSH

Frecvent se aplica tratamentele cu PMSG, care necesita un timp mai redus, micsoreaza stresul animalelor, nefiind necesara repetarea administrarilor hormonale. Pentru cresterea eficacitatii acestei medode de stimulare a poliovulatiei, se asociaza cu folosirea si a anticorpilor anti-PMSG sau cu progesteronul absorbit pe pesarii vaginale. Recent, in acelati scop, se utilizeaza si PGF α administrata la 48 ore dupa tratamentul hormonal sau HCG, care are ca efect stimularea ovulatiei.

Sincronizarea estrului receptoarelor si donatoarelor

Aceasta operatiune este obligatorie pentru reusita transferului de embrioni si se poate realiza pe doua cai: naturala (nehormonala) si hormonala.

Sincronizarea naturala consta in introducerea berbecilor in turma din care vor fi selectionate oile pentru transfer, cu conditia ca starea de intretinere a animalelor sa fie buna, iar furajarea corespunzatoare din punct de vedere cantitativ si calitativ. Prin feromonii elaborati, berbecii stimuleaza functia de reproducere a oilor.

Daca oile sunt tratate in prealabil cu progesteron impregnat in bureti vaginali si introdusi in aparatul genital cu 6 - 12 zile inainte de aducerea berbecilor in turma, atunci acestea vor fi mai receptive la stimulul natural, se vor reduce caldurile sterse, iar manifestarile estrale vor apare la 36 - 40 ore dupa extragerea buretilor.

Sincronizarea hormonala consta in utilizarea prostaglandine si progesteron. Dintre prostaglandine, la oaie se utilizeaza frecvent cloprostenolul administrat in timpul fazei luteale a ciclului estral.

Cea mai utilizata metoda de sincronizare este administrarea progesteronul sub forma de bureti vaginali (impregnati cu Chronogest, Reprom, Prid), implante subcutanate, pesarii, administrare pe cale orala, injectii subcutanate.

Recoltarea embrionilor, controlul calitatii lor si transferul

Momentul optim al recoltarii embrionilor variaza in functie de tehnica utilizata. Cand se face o recoltare precoce, in ziua a 3-a, se poate face o spalare unica a oviductelor, deoarece in acest interval embrionii se gasesc in totalitate la nivelul acestor segmente. La 4 - 7 zile de la fecundatie, recoltarea se poate face prin asocierea spalarii oviductelor si coarnelor uterine. Exista tehnici nechirurgicale si chirurgicale de recoltare a embrionilor.

Metode nechirurgicale de recoltare a embrionilor sunt: cateterismul cervical si endoscopia, care presupune folosirea unei sonde cu 3 circuite.

Metode chirurgicale de recoltare a embrionilor se face in ziua 4 - 5 si include parcurgerea urmatoarelor etape:

anestezia generala si locala a femelei donatoare

contentia donatoarei in decubit dorsal

laparatomia pe linia alba, cat mai aproape de simfiza ischio-pubiana

exteriorizarea aparatului genital

realizarea unui circuit ac bont - oviduct - corn uterin - canula - cateter - placa de recoltare - pahar colector cu pereti dubli

spalarea cornului uterin cu 20 - 30 ml mediu specific

evidentierea embrionilor la stereolupa

punerea embrionilor in mediu de cultura

administrarea de antibiotice intraperitoneal la donatoare

sutura peritoneului, a tunicii abdominale si a pielii

Transferul de embrioni la ovine se face, in special, prin metoda chirurgicala, care consta in urmatoarele:

anestezia generala si locala a femelei receptoare

laparatomia pe linia alba a receptoarelor

evidentierea cornului uterin ipsilateral ovarului cu corp galben

depunerea embrionului cu ajutorul unei pipete din plastic sau a unei seringi speciale, inclus in 0,3 - 0,5 ml mediu

Locul de depunere trebuie sa corespunda cu locul de dezvoltare a embrionului transferat. Daca recoltarea s-a facut la 3 - 4 zile de la fecundatie, transferul trebuie sa se faca in treimea inferioara a oviductului.

Aprecierea calitatii embrionilor se face dupa recoltare si pana in momentul transferului sub raportul viabilitatii si a sanselor de continuare a dezvoltarii. Se face identificarea si clasificarea embrionilor cu ajutorul unei lupe binoculare.

Se separa embrionii unul cate unul si se pun intr-o placa cu mediu de cultura PBS, la temperatura de 25C. Prin numararea embrionilor identificati se poate calcula procentul de embrioni recoltati si efectul tratamentului superovulator.

Aprecierea viabilitatii embrionilor se poate realiza prin metode morfologice, biochimice, histologice si cultivare in vitro.

Conservarea embrionilor

In ultimul deceniu s-au inregistrat progrese remarcabile in conservarea embrionilor prin congelare, aceasta avand ca scop comercializarea embrionilor din rase valoroase, importuri si exporturi de material genetic, posibilitatea transportului lor pe distante mari, evitarea raspandirii unor boli, conservarea raselor indigene. Metodele de conservare pot fi de scurta durata si de lunga durata.

Conservarea pe durata limitata se poate realiza la temperatura camerei, timp de 9 ore, prin cultivare 24 - 48 ore la 37C, in medii speciale, dar rata gestatiilor este mai mica decat in cazul transferului efectuat imediat dupa recoltare.

Conservarea pe lunga durata presupune congelare, de regula, in paiete.

Etapele congelarii embrionilor de animale sunt:

aditionarea progresiva a unui crioprotector

racirea la temperatura sub 0C

inducerea formarii cristalelor de gheata in mediu extracelular

congelarea usoara pentru a permite deshidratarea treptata a celulelor embrionare

imersarea in azot lichid

Decongelarea vizeaza incalzirea embrionilor congelati si indepartarea crioprotectorului.

Eficienta congelarii embrionilor in paiete se determina prin aprecierea rezultatelor dupa transfer la receptoare, prin compararea ratei de supravietuire obtinuta dupa stocare cu rata utilizarii embrionilor necongelati, respectiv prin ponderea produsilor viabili obtinuti.

Bibliografie selectiva:

Ladosi Ioan 1999. Embriotehnologie animala. Editura Victor Melenti, Cluj-Napoca.

Zamfirescu Stela, Sonea Alexandru 2004. Biotehnologii de reproducere la rumegatoarele mici, Editura Ex Ponto, Constanta

Angela Stoica, Sonea Alexandru, 2003. Metode de intensivizarea a

Paul Tapaloaga, Paula Dragut reproductiei la mamifere si pasari, Editura Granada, Bucuresti

Grandin, T, and M. J. Deesing 1998. Genetics and Behavior during handling and restrain. In Genetics and Behavior of Domestic Animals. Academic Press. San Diego, CA

www.sheep101.info/201/ewerepro.html

www.nzsheep.co.nz