CATEGORII DOCUMENTE |
Alimentatie nutritie | Asistenta sociala | Cosmetica frumusete | Logopedie | Retete culinare | Sport |
HORMONI-INSULINA
Hormonii se pot defini ca
substante organice de natura endogena, secretate in cantitati extrem de mici de
glande endocrine sau de alte tesuturi specializate, care patrund prin circuitul
sanguin in tot organismul si au proprietatea de a stimula si coordona
functionarea unor organe sau tesuturi-tinta, procese metabolice sau activitatea
intregului organism. Deci hormonii isi manifesta actiunea asupra unor organe si
tesuturi mai indepartate de locul secretiei, fara a exclude posibilitatea lor
de a actiona si asupra unor celule si tesuturi foarte apropiate de locul de
secretie(cazul testosteronului). Actiunea inalt specializata a hormonilor nu
este receptionata decat de formatiuni celulare caracteristice si capabile de a
intercepta actiunea unui hormon, care are o anumita structura chimica.
Cuvantul hormon provine din limba
greaca(hormao=a stimula, a activa, a pune in miscare) si a fost introdus in
stiinta de catre Ernest Henry Starling (1866-1927) in anul 1905. Necesitatea introducerii
unui termen stiintific cu caracter de generalizare s-a ivit imediat dupa ce au
fost cunoscute substante biologic-active care isi manifesta actiunea
biostimulatoare mai departe de locul secretiei. In acest sens se poate
exemplifica descoperirea secretiei de catre Bayliss si Starling (1902), hormon
care stimuleaza secretia pancreasului( secretina fiind un hormon tisular produs
de mucoasa duodenala).
Cel care intuieste pentru prima data existenta
unor secretii interne a diferitelor organe este medicul francez Theofile de
Bordeu (1775),ce poate fi conjsiderat un premergator al endocrinologiei. Karl
Adolf won Basedow(1799-1854) si predecesorii sai Caleb Ilillier Parry si Robert
James Graves descriu hipertiroidismul(1825-1840). Observatii asupra functionarii
glandelor suprarenale Thomas Addison (1793-1860) care, in 1855, a descris
insuficenta corticosuprarenala, cunoscuta sub numele de boala lui Addison.
In anul 1855, filozoful francez Claude Bernard
(1813-1878) a introdus termenul "secretie interna", facand diferenta inter
secretiile glandulare externe si interne, putand fii considerat un pionier al
endocrinologiei. El a pus in evidenta functia glicogenetica a ficatului si
rolul pancreasului in digestia grasimilor, facand dovada secretiei interne a unui
organ.
Unul dintre fondatorii acestei discipline
stiintifice pe plan mondial si intemeietorul scolii romanest de endocrinologie
este savantul Constantin I. Parhon(1874-1969) care impreuna cu M. Goldstein au
publicat la Paris(1909) prima carte din lume ce trateaza probleme de
endocrinologie cunoscute la acea vreme, intitulata : Les Secretion Internes
(Pathologie et Physiologie).
Glandele
sunt organe existente in corpul uman si animal unde au rol de a elabora si
secreta anumite substante, unele biologic-active.
Dupa mediul in care isi expulzeaza secretia,
glandele se clasifica in glande exocrine sau cu secretia externa si glande
endocrine sau cu secretia interna. Din prima categorie fac parte glandele
salivare, stomacale, intestinale, mamare, sudoripare si altele. Din cea de a
doua categorie fac parte alte glande care sunt lipsite de o conducta de
eliminare, produsele lor de secretie patrunzand direct in sange, deci intr-un
mediu din interiorul organismului(endo-inauntru si crincin-a elimina). Unele
glande au caracter mixt, de exemplu pancreasul, ovarele.
Existenta unor organe cu rol major in
coordonarea proceselor biologice a fost observata inca din antichitate :
Hipocrat din Kos(460-375 i.e.n), Galenus (130-200 sau 210)
Glandele endocrine prezinta cateva proprietati
particulare si anume o structura histologica proprie, fiind alcatuite din
celule in care se produce biosinteza hormonilor care, dupa secretie, patrund
direct in sange. Celulele secretoare sunt specializate, ele avand proprietatea
de a produce compusi biologic-activi, care au o anumita structura chimica. Cantitatea de hormon secretata este
variabila, activitatea glandei fiind reglabila. Exista o stransa legatura intre
functionarea glandelor endocrine si produsele biologic-active secretate de ele,
adica hormonii secretati pot interveni stimuland sau inhiband activitatea de
secretia a altor glande.
Se cunosc mai multe criterii de clasificar a
hormonilor :
a) Dupa glanda in care sunt elaborati : hormoni
tiroidieni, suprarenali, sexuali, epifizari si ai glandei timus. Se observa ca,
dupa aceasta clasificare, hormonii au structuri chimice si proprietati
biologice diferite.
b) Dupa structura chimica a moleculei :
-hormonii derivati din aminoacizi (tiroxina,
adrenalina, noradrenalina si alti) -hormoni
peptidici si proteici avand moleculele formate prin incatenarea aminoacizilor
prin legaturi peptidice. Ca exemple de hormoni peptidici : hormonii pancreatici
(insulina si glucagonul) si ai hipofizei posterioare (ocitocina si vasopresina)
etc. Hormonii proteici au molecula alcatuita dintr-un numar mare de aminoacizi
incatenati de asemenea prin legaturi peptidice, formand macromolecule proteice
: hormonul paratiroidian (parathormonul), hormonii hipofizei anterioare
(hormonul de crestere, hormonul adrenocorticotrop etc), hormonii hipofizei
intermediare. Hormonii cu structura proteica se numesc si preteohormoni ;
-hormoni steroizi, derivati ai sterolilor :
hormoni cortico- suprarenali si sexuali (hormonii ovarieni si testiculari).
c) Se poate considera si un al treilea criteriu
de clasificare a hormonilor, acela al proceselor biologice asupra carora
ctioneaza hormonii : hormoni cu actiune metabolica, hormonii cu actiune
morfogenetica, hormoni cu actiune endocrina, deci care actioneaza asupra
functiei altor glande.
PANCREASUL, asezat in spatele partii
inferioare a stomacului, a fost descris pentru prima oara in 1642 de catre
medicul bavarez Wirsung. Pancreasul poate fi regasit la toate animalele
vertebrate. La om, el are o forma alungita, putandu-se deosebi trei parti ale
organului: capul, corpul si coada pancreasului. Greutatea sa oscileaza intre 70
si 160 g la omul adult.
Din punct de vedere functional, pancreasul
reprezinta o glanda mixta, avand o secretie externa si una interna. Ca organ
exocrin, glanda produce si varsa in duoden, prin canalul lui Wirsung, sucul
pancreatic, format dintr-o serie de fermenti si avand un rol important in
procesele de digestie intestinala ale glucidelor, lipidelor si proteinelor.
Sucul pancreatic este produs de tesutul acinar al glandei. In afara de acini,
pancreasul contine formatii celulare raspandite printre tesutul acinar,
frecvente in special in regiunea cozii organului, denumite insulele lui
Langerhans, dupa numele autorului care le-a descris pentru prima oara in 1869.
Laguesse (1895) a pus in evidenta rolul endocrin al insulelor lui Langerhans, a
caror secretie a fost numita (1909) de catre Meyer "insulina",denumire sugerand
provenienta. Insulele lui Langerhans sunt alcatuite din celule diferite :
- celule a, mai voluminoase, in proportie de
20-25%,care secreta glucagonul ; - celule ,mai
mici,in proportie de 65%, care secreta insulina ; celule ?,in proportie de
circa 5%, care secreta vagotonina si urme de gastrina ; celelalte tipuri de
celule, in proportie de 5%, sunt celule d sau inca alte doua tipuri de celule
;dintre acestea, celulele d par sa aiba o modesta functie endocrina, elaborand
un polipeptid numit somatostatina,care are o viata scurta ;este eliberat si de
hipotalamus.
O data importanta in istoria studiului
pancreasului este anul 1889, cand Mering si Minkowski au obtinut la caini
sindromul de diabet zaharat prin extirparea totala a glandei.Aceasta experienta
a contribuit hotarator la stabilirea originei unei boli cunoscute de milenii si
a deschis calea catre descoperirea activitatii endocrine a pancreasului. Cu
studiul pancresului s-a ocupat si fiziologul roman Nicolaie
Paulescu(1869-1931), care a obtinut pentru prima data (10 aprilie 1921) un
extract pancreatic cu actiune hipoglicemianta, pe care l-a numit "pancreanina".
Putin mai tarziu (1922), insulina a fost izolata de catre Banting si Best,
cercetatori canadieni, care au prelucrat pancresul bovinelor. Abel si colaboratorii
au reusit sa obtina insulina sub forma cristalina(1926). Structura chimica si
proprietati ale insulinei
Prin cercetari foarte laborioase interprinse de
E. Sanger, Tuppy si Thompson, s-a putut stabili
structura chimica a insulinei, ca fiind un polipeptid alcatuit din 51
resturi de aminoacizi.Molecula insulinei contine doua catene polipeptidice : A
si B. Prima este alcatuita din 21 resturi de aminoacizi, are caracter acid si
este spirala dreapta, iar catena B are 30 de resturi de aminoacizi, este bazica
si spirala stanga.
Cele doua catene polipeptidice sunt unite prin
punti disulfurice -S-S- ;exista doua astfel de punti, foarte sensibile la
oxidare cand, in prezenta de acid performic, se transforma in grupe sulfonice
(-SO3H).S-au identificat 17 aminoacizi diferiti in structura insulinei, unii
dintre ei repetandu-se, de exemplu :glutamina, asparagina, leucina, cisteina,
glicina, tirozina, fenilalanina, alanina.
S-a precizat ca legatura disulfurica intre cele
doua catena se stabileste intre cisteina 7 din catena A si cisteina 7 din
catena B, iar cea de a doua punte se stabileste intre cisteina 20 din catena A
si cisteina 19 din catena B. Mai exista si o a treia punte disulfurica, care nu
este intercatenara, ci intracatenara, stabilita intre cisteina 6 si cisteina
11, apartinand catenei A ;de aceste doua molecule de cisteina mai sunt legati
inca patru aminoacizi, formand un ciclu, molecula de cisteina 7 din acest ciclu
contribuind la reticularea celor doua catene A si B.
Desi pe cale analitica rezulta existenta a 51
resturi de aminoacizi in structura chimica a insulinei, asa cum rezulta si din
formula polipeptidica de mai sus, se poate interpreta totusi ca exista numai
48, deoarece se poate admite ca cele trei punti disulfurice sunt cistinice, ele
apartinand unui singur aminoacid (cisteina), care este singurul ce poate lega
covalent, reticuland, cele doua catene polipeptidice.
Insulina e
prezinta sub forma de pulbere alba, care se topeste la 233sC,are masa
moleculara relativa in jur de 6000 uam, pHi =5.4.Este solubila in mediu slab
acid, la pH=5-6, in solutii alcaline diluate, in alcool de 90%, in glicerina,
in fenol. Este insolubila in alcool absolut, cloroform, eter, acetona, benzen.
Fermentii proteolitici o distrug, motiv pentru care insulina ca medicament nu
poate fi introdusa in organism pe cale orala. In mediu alcalin, are
proprietatea de a forma asociatii moleculare de diferite marimi, avand masa
moleculara de la 36000 la 48000, asociatii determinate de cationii metalici. In
organism ea se gaseste complexata cu cationi de zinc.
Biosinteza insulinei
Fiind
un compus protidic, biosinteza insulinei are loc la nivelul ribozomilor din
reticulul endoplasmatic din constitutia celulelor ale insulelor Langerhans.
Se admite ca, mai intai, are loc sinteza unui compus polipeptidic, cu greutate
moleculara mai mare decat a insulinei, numit proinsulina.La randul ei
proinsulina ar rezulta prin hidroliza enzimatica din alt compus, cu greutate
moleculara si mai mare, numit preproinsulina, dupa schema :
Preproinsulina ? Proinsulina ? Insulina
Proinsulina care apare la nivelul ribozomilor
este transformata in insulina, in cursul trecerii ei spre complexul Golgi.
Descoperirea proinsulinei a rezultat din studiul
adenomului insular secretor de insulina. La probe in vivo, proinsulina prezinta
numai 15-20% din activitatea insulinei. Ea contamineaza produsele uzuale de
insulina si reactioneaza cu antiserurile folosite in radioimunoanaliza (RIA),
dar nu reactioneaza identic cu serurile antiinulina purificata.
Se obtine industrial prin extractie din
pancreasul animal si prin biosinteza cu bacterii sau drojdii manipulate
genetic. Foarte bune sunt si insulinele bovina si porcina, care difera doar
prin succesiunea aminoacizilor 8-10 din catena A. La bovine aceasta succesiune
este ASV (si 30T este inlocuita cu 30A ), la ovine AGV, lacabaline TGI. La
insulina porcina si cea de iepure, foarte asemanatoare celei umane, succesiunea
este aceeasi (TSI) dar, ca si la bovine, apare Ala in locul 30Tre. Prin
scindarea cu tripsina a alaninei finale rezulta desalanino-Ins porcina, inca
mai asemanatoare ca proprietati celei umane. In urmatorul tabel se dau
pozitiile si resturile de aminoacizi prin care difera diversele insuline.
Obtinerea
insulinei se face prin procesul extractiv din pancresul porcin sau/si bovin sau
prin biosinteza cu folosirea bacteriilor manipulate genetic.
Procesul clasic de obtinere a insulinei se
mai aplica inca (?) la Biofarm-Bucuresti, sectia "opoterapice", unitate in care
se obtin si alte preparate de extractie din tesuturi animale si vegetale utile
terapeutic. Este format din etapele de extractie, debalastare de proteine,
debalastare de lipide, precipitere a produsului brut si recristalizari multiple
pana la o concentratie de 24 UI/mg proteina (fata de un etalon international
care in 1982 mai era de 22,1 UI/mg proteina).
Se prelucreaza amestecul 1:3 de pancreas bovin
(mult) si porcin (bun) refrigerat la -20sC in abatoare pentru conservare,
depozitare si transport. Modul de conservare se apreciaza prin indicii de
alterare (indicele de formol<5).
Procesul se bazeaza pe solubilitate in mediu
acid, in mediu alcalin si in alcool 90%, insolubilitate in acetona, scaderea
solubilitatii la salefiere si solubilitatea minima la pH=6.1 (izoelectric) a
complexului cu zinc a amestecului de insulina porcina si bovina. Se exploateaza
stabilitatea in mediu acid si se evita mediul alcalin, in care insulina este
instabila. Se aplica metodele de precipitare cu solvent, la pHi si in mediu
salin si se utilizeaza proprietatile amfotere ale proteinelor.
Amestecul de pancreas se macina fin si se
extrage 3 ore cu etanol 93% acidulat cu acid clorhidric la pH=2-3. Se
centrifugheaza si turta de tesut se mai extrage o data timp de 2 ore cu alcool
acidulat. Dupa filtrare tesutul epuizat se arunca.Filtratele, eventual filtrate
inca o data, se aduc cu solutie amoniacala la pH=7-7.5, cand o parte din balastul
proteic precipita si se centrifugheza (se trece la recuperarea alcoolului).
Aceasta operatie se face rapid pentru a evita inactivarea in mediu slab bazic.
Filtratul se aduce cu acid sulfuric la pH=3.7-4.3 cand precipita alt balast
proteic, care se indeparteaza prin filtrare.
Solutia alcoolica diluata se concentreaza la
maxim 30sC/30 torr la 1/10 din volum, cand se recupereaza majoritatea
alcoolului folosit. Ramane un concentrat apos de insuline brute, in care
lipidele nu mai sunt solubile. Pentru a nu se pierde insulina, se aduce cu acid
sulfuric la pH=2.2-2.5 , unde insulina este stabila si solubila, apoi la cald
se filtreaza un balast lipidic. Solutia limpede se satureaza cu sare, solutia
salina se raceste la 5-10sC, cand precipita insulina bruta, care se ridica
la suprafata saramurii ca o turta compacta. Se colecteaza manual. Din saramura
si depozitul de sare se recupereaza resturile de insulina bruta. Prin diluare
cu apa la 20%NaCl depozitul de sare se solubilizeaza si se recupereaza resturile.
Pentru purificare se apeleaza la pH-ul
izoelectric al complexului Zn.I. Acesta este distrus in mediu acid, in care I
este stabila si solubila, iar in mediu alcalin ionul de zinc se elimina fie ca
ZnO fie ca si complex [Zn(NH3) 2]2+. In pH=6.1 , relizat cu tamponul acid
citric/citrat de amoniu, solubilitatea este minima si produsul precipita sau
cristalizeaza functie de viteza de insolubilizare.
Toate operatiile in continuare se executa in
camera frigorifica pentru a preveni inactivarea I la pH=7, iar aducerea la 6.1
se face totdeauna din mediu acid.
Pentru aceasta produsul brut se solubilizeaza la
t=5sC in solutie apoasa acetonica cu AcOH, apoi cu amoniac se aduce la
pH=6.1. I ramane solubila in schimb impuritati proteice precipita si se
indeparteaza prin filtrare. Prin introducere de acetat de zinc la solutia
tamponata la 6.1 precipita Zn.Ins purificata si precipitatul floconos amorf se
filtreaza dupa pastrare 24 de ore la 0-5sC.
O forma mai pura rezulta la cristalizarea
acestuia in aceleasi conditii. Precipitatul se solva in solutie apoasa acida
(acid clorhidric si acid citric) se reduce constanta dielectrica cu acetona si
se adauga sare de zinc pentru stabilizarea Zn.Ins. Se aduca la pH=7-7.5 cu
amoniac , apoi la 6.1 cu acid citric, cand incepe sa precipuite insulina. Dupa
doua zile la 0?C se centrifugheaza o forma cristalizata , care se spala si se
usuca la 20?C la aer.pentru purificare avansata cele 15 g produs, obtinut din
150 kg amestec de pancreas,se recristalizeaza in laborator dupa acelasi tipic
(dizolvare in mediu acid, tratare cu acetona si sare de zinc filtrarea
impuritatilor, trecerea la pH=7.5 cu amoniac apoi la pH 6.1 cu acid citric si
critalizare 1-2 zile la 0?C).Dupa cele doua recristalizari si uscare se ajunge
la insulina de 24 UI/ml cu randament de 60% fata de Ins purificata
cristalizata.
Insulina cristalizata mai contine cateva
componente , unele alergene.Prin gel-cromatografie pe Sephandex s-au putu
separa trei fractii: una are M?20 000, contine proteine pancreatice si fractii
insulinice cu potential alergent; o a doua contine proinsulina si insuline
modificate (Arg-Ins,desamido-Ins) si a treia cu continut de insulina, esteri ai
sai si unii derivati. Prin cromatografie pe ioniti, din ultima se obtine produsul
pur, insulina "Sanger" sau monocomponente (MC). Insulina bovina , cu trei
aminoacizi diferiti este mai antigenica decat cea porcina , cea amorfa mai mult
decat cea cristalizata , formele insolubilizate mai mult decat cele instant.
Cele mai multe preparate MC retard sunt constituite din 30% insulina porcina
amorfa si 70% bovina cristalizata. Este necesara HuIns pura.
Insulina
umana nu se poate obtine in cantitati industriale prin procesul extractiv din
pancreas. Ea s-a putut obtine doar ca urmare a aparitiei ingineriei genetice.
In 1978 80% din piata insulinei era condusa de Ely-Lilly Co. si valora cam 150
milioane dolari, astfel incat dupa grefarea genei insulinei umane in E.coli
la Genentechn, Ely-Lilly Inc. a incheiat un contract pe termen lung cu aceasta
si se construieste rapid o instalatie in valoare de 40 milioane dolari pentru
producerea insulinei umane. Din 1980 se putea produce deja si proinsulina, care
este mai stabila si su poate sinda enzimatic sau cu bromcian la insulina.
Cum era cuoscuta succesiunea aminoacizilor din
HuIns, sa apelat la sinteza pe cale chimica a genelor din cele doua lanturi in
locul cautarii acestora in ARNm din tesutul animal. In plus, produsele apar in
cantitatile si puritatile dorite, intr-un proces controlabil usor prin metodele
chimice traditionale, mult maiieftine si simple decat cele din chimia ARN.
Cunoscuta fiind succesiunea nucleotidelor, s-a construit prin metoda blocurilor
de pentameri si decameri cele doua gene avand la extremitati situs-uri de scindare
cunoscute. Pentru lantul A, s-a adaugat la capatul aminic formil-metionina,
semnal de capat de catena, si grupa de nucleotide caracteristice recristazei
EcoRI, iar la capatul carboxilic codoni de finalizare si secventa pentru Bam I.
Pentru lantul B se procedeaza in mod similar, folosind aceleasi secvente
terminale pentru enzime de restrictie.
Ideea este sa se obtina prin biosinteza (in vivo)
cele doua catene si sa se realizeze cele doua punti cistinice prin oxidare
ulterioara cu aer in vitro. Cele doua gene sa fie introduse in acelasi vehicul.
Drept vehicul s-a ales plasmida pBR 322 bine cunoscuta, studiata si aplicata.
Cum aceasta contine segvente de scindare pentru Eco RI si Bam HI s-au
constituit aceste secvente si la capetele 5' ale genelor sintetizate chimic.
Prin scindare plasmidei cu Eco RI si Bam HI rezulta capete adezive 5' AATTC si
5' CTAG. Acestea s-au grefat pe cele doua gene chimice pentru a ingloba in pRB
322 noua informatie.
Introdusa in E.coli, aceasta noua plasmida va
putea sintetiza o serie de polipeptide care vor contine si secventa de
aminoacizi a lantului A si B. Cum fiecare lant incepe cu formil-metionina
produsul de biosinteza se va trata cu BrCN care ataca doar metionina si
cliveaza lanturile diverselor polipeptide hidride, precursoare la nivelul
acestora. In HCl 0.1N sau acid formic, la 20?C, are loc degajare de izociantat
de metil volatil si hidroliza catenei cu formarea unei lactone homoserinice
(Hsl) terminale si eliberarea capatului aminic (?=80-90%).
Problema in aceasta tehnica este ca randamentul
de producere a acestor doua catene este altul pentru fiecare din ele si nic din
totalul de proteine sintetizate de E.coli astfel tratate. In plus, noul
caracter al tulpinilor obtinute se pierde in timp.
Toate tehnologiile de biosinteza care folosesc
microorganisme manipulate genetic au probleme cu stabilitatea mutantului. Toti
mutantii sunt instabili. Dupa un numar de multiplicari revin la forma
parentala, mai naturale, mai salbatica, mai stabila (revertanti), prin
eliminarea din gena a materialului nonself. Este o problema generala a
geneticii: genomul mai "salbatic" castiga in competitia cu cel
"artificializat".
Se constata la E.coli RR I ca pastreaza noua
plasmida pBR 322 doar cca. 60 cicluri de viata, 60 de generatii dupa care
calitatiile de producator de insulina dispar. Dar aceasta este suficient sa
produca din o celula 12 000 l de mediu de cultura cu un continut de biomasa de
10 g/l. Aceasta densitate de celule suficienta ca in ultimele 24 de ore, sau
mai putin , sa genereze HuIns, interferoni sau hormoni de crestere. Calitatea
de inalt producator se pierde odata cu pierderea plasmidei, si aceasta odata cu
pierdera rezistentei la antibiotice pe care pBR 322 o induce. E bine asa,
pentru ca astfel am invada lumea cu bacterii rezistente. In cateva ore se
sensibilizeaza la loc la antibiotice. De aici necesitatea unui stoc de cultura
pura de bacterie manipulata-inalt productuva, ce se foloseste pentru fiecare
initiere a fiecarei sarje.
Problema stabilitati devine esentiala cand se
lucreaza cu volume mari sau in flux continuu. Scaderea costurilor impune
folosirea unor tulpini cu mai multe copii ale plasmidei in genom, care sa
ramana inalt prductivi mai mult timp.
Nu trebuie uitat ca in bioreactor concentratia de
proteine utila depinde de continutul intracelular si extra celular, pe de o
parte, si de cantitatea produsa si cea pierduta prin hidroliza din cauza
proteazelor proprii celulei, pe de alta ( Cfin=Ctot - Chidr ). Apar doua
aspecte: viteza de hidroliza depinde de accesibilitatea proteinelor si de
reactivitatea proteazelor.
Proteinele mici sunt solubile in citoplasma si
rapid hidrolizate de proteaze. Daca sunt excretate , ele au un timp de
injumatatire de 10 ori mai mari. Pentru HuProIns, o proteina mica, timpul de
injumatatiree este de cca. 2 min in citoplasma celulara si de 20-25 de min in
periplasma de unde va fi excretata. Cu cat molecula e mai mica cu atat
instabilitatea ei e mai mare. Proteinele de masa moleculara mare sunt insolubile
sau putin solubile si mai putin susceptibile atacului cu proteaze celulare,
care are loc doar in solutia apoasa. Din aceasta cauza, solutia sintezie
lantului A si B individuale nu e cea mai buna. La asocierea cu o proteina mai
mare, viteza de degradare hidrolitica a proteinei utile este mai mica din cauza
solubilitatii mici a noii proteine "himera". Se procedeaza la asociera cu
-galactozidaza. Proteinele himera -gal-lant A sau -gal-proinsulina se
cumuleaza in celula si, din cauza concentratiei mari, se insolubilizeaza ca
depuneri (incluziuni) citoplasmatice. Pentru recuperarea lor este necesara o
eficienta dezagregare a peretilor celulari prin forfecarea in omogenizator la
presiune inalta.
O a doua posibilitatet este de protejare a
continutului de proteina intracelulara prin mutanti cu activitate proteolitica
diminuata. De aici necesitatea maririi masei moleculare a proteinelor
sintetizate de bacteriile manipulate si folosirea de mutanti deficienti in
proteaze.
O marire a randamentului de producere a celor
doua lanturi se realizeaza printr-o varianta ceva mai "naturala" (mai putin
artificiala). In loc sa se forteze introducerea celor doua gene in pBR 322
apartinand E.coli se utilizeaza doua tulpini diferite, fiecare va fi dopata cu
o plasmida cotinand gena pentru un singur lant. Pentru selectarea mai usoara a
tulpinilor ce contin aceasta gena recombinata si marirea caracterului de
"natural" se asociaza gena cu cea a - galactozidazei (operonul lac) sau
operonul sintezei triptofanului. Legatura se face prin intermediul unei
metionine, care sa permite scindarea ulterioara. Se amplifica si identificarea
celulelor purtatoare a noii gene. Coloniile bacteriilor producatoare de -
galactozidaza se coloreaza in albastru.
Separarea celor doua lanturi se face prin
procedeele conventionale (Goeddel 1979, Riggs 1981). La sfarsitul biosintezei
proteina - gal -A (- gal-B) atinge pana la 20% din proteina celulara, sub
forma insolubila in corpusculi citoplasmatici. Prin distrugerea peretilor
celulari omogenizatoare eficace si centrifugarea fazei solide se obtine un
concentrat cu peste 50% concentratie (aparitia incluziunilor intracelulare
coincide cu acumularea proteinei himere). Acesti corpusculi-incluziuni contin
compusi in care catena A , catena B si proinsulina sunt legate de -
galactozidaza (operonul lac), de operonul triptofonului sau de portiuni din
acesti operoni. Urmeaza sa se separe himerele prin precipitarea, apoi lanturile
utile sa se obtina prin clivare cu bromcian, in acid formic 70%, la temperatura
camerei, in 12 ore. Lanturile A si B s-au transformat in derivat S. sulfonat,
care s-a putut purifica prin cromatografie pe ioniti si prin gel-cromatografie.
Dupa purificare, cele doua catene se cupleaza prin oxidare cu aer.
Clivarea este usurata de faptul ca legatura intre
lantul C si celelalte doua se fac prin resturi de aminoacizi puternic bazici :
Arg si Lis. Ori aceasta sugereaza ca hidroliza enzimatica sa se faca de ex. cu
tripsina. Inevitabil va rezulta si Arg- Ins, cu un rest pastrat la un capat
carboxilic al lantului B, care se elimina prin acelasi tratament cu tripsina
sau cu o proteaza activa asupra capatului carboxilic.
De interes doar academic se bucura biosinteza
pre-proinsulinei de sobolan (Ulrich,1977). Aceasta este atasata de un
pre-peptid suplimentar de 20 de aminoacizi, la capatul aminic al proinsulinei:
H-(prepeptid)-(catena B)-(lant C)-(catena A)-OH. S-a separat mARN ppIns din
celulele pancreatice si s-a sintetizat gena corespunzatoare cu
revers-transcriptaza virusului mieloblastozei aviare, careia mARN i-a servit
drept matrita. Din sinteza rezulta hibridul ARNm - ADNc, din care se elimina cu
alcalii 0.3M polinucleotidul ARN, se re foloseste revers-transcriptaza pentru
sinteza ADN bicatenar cu cADN matrita, iar scurta secventa monocatenara se
elimina cu exonucleaza S l. La capetele drepte ale acestei gene s-au adaugat cu
AND-ligaza T4 secvente de scindare (5'- CCA ? AGCTTGG-3') pentru HindIII, apoi
cu aceasta restrictaza s-au constituit capetele adezive. Vehicolul s-a ale a fi
plasmida pBM9, si ea posesoare a unui situs pentru HindIII. Amestecul din noua
gena si plasmida pMB9 deschisa cu HindIII, s-a tratat cu AND- ligaza T4, drept
care a rezultat o plasmida purtatoare a genei preproinsulinei de sobolan.
Introdusa in E.coli ?1776, aceasta a produs peptidul corespunzator, care se
poate scinda biochimic sau chimic.
O varianta de obtinere a insulinelor este
sinteza chimica prin metoda blocurilor de 2-7 aminoacizi condensati in scurte
secvente utile. Este o metoda eleganta, de rafinament stiintific dar care nu
poate ramane decat una academica, fara aplicatii practice. Etapele multiple, in
care fiecare aminoacid se protejeaza, activeaza, condenseaza, desacileaza este
foarte laborioasa. Sunt cunoscute cateva sinteze (de ex. Maienhofer 1963), care
au fost necesare pentru confirmarea structurii si studierea activitatii
similariilor de sinteza.
Zincul este un microelement esential pentru
organismele vii. Zincul (Zn) se afla ca bioconstituent al unor metalo-enzime: carboxipeptidaza,
fosfataza alcalina, lactic-dehidrogenaza, glutamic-dehidrogenaze,
aminopeptidaze, DNA-polimeraza, RNA-polimeraza, Zn-Cu superoxid-dismutaza
precum si cofactor in sensul de "efector metabolic" cu rol activator al unor
altor unzime: arginaza, enolaza, oxalacetic-decarboxilaza, izomeraza, aldolaza.
De asemenea, intervine in actiunea unor hormoni: insulina (in structura
acesteia aflandu-se cca. 0.153% Zn),hormoni gonadotropi hipofizari, favorizand
fecundatia.
Insulina este un hormon, secretat de insulele lui Langerhans din pancreas, ce participa la metabolismul glucidelor. Insulina are o actiunea antagonista glucagonului.
Din punct de vedere al fiziologiei, insulina este un hormon, ce este compus din 2 lanturi peptidice, formate din 20 - 30 aminoacizi, unite intre ele prin 2 legaturi bisulfidice. Moleculele de insulina sunt asemanatoare la mamifere, astfel incat multi bolnavi de diabet sunt tratati cu insulina extrasa de la porci. Aceste molecule tind sa formeze dimeri in solutie.
Biochimic insulina este o proteina mica cu masa de 5734 daltoni si cuprinde 51 resturi aminioacidice. Este alcatuita din doua lanturi, un lant A (cu 21 resturi aminoacidice) si unul B (cu 30 resturi aminoacidice) legate prin doua punti disulfurice (A7-B7 si A20-B19); o a treia legatura disulfurica leaga restul Cys-A6 cu Cys-A11. Insulinele altor specii difera de cea umana. Diferenta cea mai mica exista intre insulina umana si cea de porc, acesta deosebindu-se numai prin natura restului C-terminal al lantului B. La om este treonina, la porc alanina. Insulina de porc din care s-a detasat treonina terminala este practic lipsita de antigenicitate si este folosita in tratamentul diabetului. Prin tehnologia ADN recombinant s-a obtinut insulina umana pentru uz terapeutic. Insulina formeaza cu ionii Zn2+ agregate, dimeri, tetrameri, hexameri. In pancreas insulina se afla sub forma de hexameri. Forma activa circulanta este probabil monomerul.
Insulina este sintetizata in insulele lui Langerhans, pancreas, de catre celulele-beta. Sinteza acesteia cuprinde cateva etape:
-dupa gena insulinei, aflata in cromozomul al 11-lea, se formeaza ARn-ul corespunzator;
-dupa mARN-ul dat (ARN mesager), este translat un lant peptidic, care introdus in reticulul endoplasmatic, se transforma in proinsulina;
-dupa expunerea proinsulinei la unele endopeptidaze, apare forma matura a insulinei.
Insulina, ca si alte proteine secretorii, este sintetizata sub forma unui precursor, pre-pro-insulina. Segmentul N-terminal, pre, cu 23 aminoacizi, peptidul semnal hidrofob are rolul de a conduce polipeptidul nascand in cisternele reticulului endoplasmatic unde este indepartat. Proinsulina, polipeptid cu 86 resturi aminoacidice, cuprinde lanturile A si B ale moleculei virtuale de insulina legate prin punti disulfurice. Capatul N-terminal al lantului A este legat de capatul C-terminal al lantului B prin intermediul unui peptid de legatura.
Proinsulina este transportata din reticulul endoplasmatic in aparatul Golgi unde este transformata in insulina. Prelucrarea proinsulinei are loc sub actiunea unei endopeptidaze care rupe doua legaturi peptidice flancate de resturi aminoacidice bazice. Rezulta trei fragmente asupra carora actioneaza o carboxipeptidaza care detaseaza resturile de arginina si lizina de la capatul C-terminal al lantului B (din insulina) si la peptidului de legatura. Complexitatea structurala a proinsulinei este necesara stabilirii corecte a puntilor disulfurice din insulina. Lanturile A si B separate nu se pot organiza spontan in molecula activa a insulinei.
Insulina, peptidul C si o cantitate mica de proinsulina sunt incorporate in granule secretorii si sunt eliberate impreuna in circulatie.
Reglarea secretiei de insulina se realizeaza prin mecanism de feed-back. Concentratia glucidelor din sange (glicemia) este factorul declansator si reglator principal al secretiei de insulina. Glicemia jeun (80-100 mg/dl) este suficienta pentru a declansa secretia de insulina.
Eliberarea insulinei creste odata cu glicemia, raspunsul maxim obtinandu-se la 300-500 mg/dl.
In afara de glucoza multi alti factori influenteaza secretia de insulina:
- alte monozaharide usor metabolizabile ca fructoza, manoza au efect stimulator;
- aminoacizii, in special arginina, lizina si leucina, stimuleaza puternic secretia de insulina;
- agonistii α-adrenergici inhiba secretia de insulina; adrenalina prin α-receptie este un inhibitor fiziologic al secretiei de insulina;
- somatostatina, produsa de celulele D din pancreas, prin actiune paracrina, inhiba secretia de insulina;
- GIP (Gastric Inhibitory Polypeptide), polipeptid eliberat de mucoasa duodenala si jejunala la ingestia de glucoza, stimuleaza eliberarea de insulina; actiunea GIP explica constatarea mai veche ca glucoza administrata oral este un secretagog mai puternic pentru insulina decat glucoza administrata intravenos.
Timpul de injumatatire al insulinei este de 3-5 minute. Insulina este inactivata in principal in ficat, prin doua mecanisme:
a) desfacerea legaturilor disulfidice interlant printr-o reactie de schimb cu glutation, catalizata de glutation-insulin transhidrogenaza. Lanturile A si B sunt degradate rapid prin proteoliza;
b) o proteaza specifica ataca molecula de insulina ce atare.
Insulina este cel mai important hormon in metabolismul glucidelor. Insulina contribuie in primul rand la micsorarea concentratiei glucozei in sange. Aceasta mareste permeabilitatea membranei celulare pentru glucide.
Concentratia normala de glucoza in sangele omului trebuie sa se mentina intre 70 si 110 mg/dl. Daca concentratia este mai mica de 70 mg/dl, atunci este hipoglicemie. Daca concentratia se afla intre 110 - 180 mg/dl, atunci concentratia se mentine in limite relativ normale, si poate semnifica ca persoana data a consumat de curand produse bogate in glucide. Daca insa concentratia de glucoza este peste 180 mg/dl, atunci este un caz evident de hiperglicemie.
Insulina de asemenea participa la transformarea glucozei in glicogen (substanta de rezerva), si la depozitarea glicogenului in ficat.
Hiperseceretia insulinica care are loc pe cale vagala; aceasta duce la o crestere a consumului tisular periferic de glucoza. Din aceasta cauza in citoplasma are loc o sinteza excesiva de lipide. Cunoscandu-se acest efect se bazeaza administrarea terapeutica de doze mici si repetate de insulina pentru a se obtine un efect hiperponderal.
Insulina participa la sinteza acizilor grasi in ficat, stimuland lipogeneza. Aceasta de asemenea poate inhiba descompunerea lipidelor din tesutul adipos, prin inhibarea lipazei intracelulare.
Insulina are un rol important in sinteza proteinelor, prin cresterea transportului de aminoacizi in cadrul celulelor. Poate astfel accelera sinteza proteinelor in cadrul muschilor.
De asemenea, insulina poate stimula cresterea organismelor.
Nicolae Constantin Paulescu (n. 8 noiembrie , Bucuresti; d. 19 iulie , Bucuresti), om de stiinta roman, medic si fiziolog, profesor la Facultatea de Medicina din Bucuresti, a descoperit hormonul antidiabetic elaborat de pancreas, numit mai tarziu Insulina.
Inca din anii liceului, a dovedit o deosebita inclinare pentru stiintele naturale, pentru fizica si chimie, precum si pentru limbile straine, clasice si moderne. Nicolae Paulescu a studiat medicina la Paris, incepand cu anul , obtinand in titlul de Doctor in Medicina cu teza 'Recherches sur la structure de la rate' ('Cercetari asupra structurii splinei'). A lucrat in spitalele din Paris, mai intai ca extern ( - ), apoi ca intern ( - ) si ca medic secundar la spitalul Notre Dame du Perptuel-Secours ( - ). In anii - a urmat si cursurile de chimie biologica si fiziologie generala la Facultatea de Stiinte din Paris, obtinand in titlul de Doctor in Stiinte cu lucrarile 'Cercetari experimentale asupra modificarilor ritmului miscarilor respiratorii si cardiace sub influenta diverselor pozitii ale corpului' si 'Cauzele determinante si mecanismul mortii rapide consecutiva trecerii de la pozitia orizontala la cea verticala'. In anul , obtine la Universitatea din Paris al doilea doctorat in stiinte cu dizertatia 'tude comparative de l'action des chlorures alcalines sur la matire vivante' ('Studiu comparativ asupra actiunii clorurilor alcaline asupra materiei vii').
In anul se reintoarce in tara si este numit profesor de Fiziologie la Facultatea de Medicina si Director al Clinicii de Medicina interna de la spitalul St. Vincent de Paul din Bucuresti.
Nicolae Paulescu a desfasurat o remarcabila activitate de cercetare stiintifica in domeniul fiziologiei, privind in special metabolismul glucidelor, patogeneza diabetului zaharat, rolul pancreasului in asimilitia nutritiva, coagularea sangelui, mecanismul mortii subite s.a. In a elaborat o metoda originala de extirpare a hipofizei la caine pe cale trans-temporala, care ulterior va fi aplicata in chirurgia hipofizei la om.
Se cunoaste mai putin astazi faptul ca Nicolae Paulescu era creationist.
In sesiunea din 23 iulie a Societatii de Biologie, Nicolae Paulescu prezinta in patru comunicari rezultatele cercetarilor sale privind actiunea extractului pancreatic in cazurile de diabet. Aceste comunicari au fost publicate in 'Comptes rendues des sances de la Socit de Biologie et de ses filiales', 1921, vol. LXXXV. no. 27, Paris, Ed. Masson et Comp. Paulescu publica descoperirea principiului activ antidiabetic din pancreas, pe care il denumeste pancreina, si in revista de specialitate din Belgia, 'Archives Internationales de Physiologie', vol. XVII, intr-un articol care a aparut la 31 august , sub titlul: 'Recherches sur le rle du pancras dans l'assimilation nutritive'. Desi aceste publicatii au precedat cu 8-10 luni enuntarea de catre Fr. Grant Banting si Ch.Herbert Best din Toronto (Canada) a descoperirii insulinei (noua denumire data principiului activ din pancreas), Premiul Nobel pentru fiziologie si medicina din anul a fost acordat cercetatorilor canadieni.
Raspunzand campaniei internationale de restabilire a adevarului initiata de fiziologul scotian Ian Murray, Comitetul Nobel recunoaste in meritele si prioritatea lui Nicolae Paulescu in descoperirea tratamentului antidiabetic. Profesorul A.W.K. Tiselius, directorul Institutului Nobel, deplange situatia din , dar - conform statutelor Comitetului - exclude posibilitatea unei reparatii oficiale, exprimandu-si doar speranta ca 'opera de pionerat' a lui Paulescu va fi elogiata cum se cuvine de forurile stiintifice internationale. Cu ocazia semicentenarului descoperirii insulinei, aceste foruri au recunoscut in mod unanim prioritatea savantului roman. In cartea 'The Priority of N.C. Paulescu in the Discovery of Insulin' ( ), profesorul Ioan Pavel a prezentat documente incontestabile care atesta meritele lui Paulescu.
In anul 1990, Nicolae Paulescu a fost numit post mortem membru al Academiei Romane.
Imaginea omului de stiinta Nicolae Paulescu este umbrita de opiniile sale ideologice de extrema dreapta, exprimate in numeroase scrieri - de pilda 'Spitalul, coranul, talmudul, cahalul si francmasoneria' - si in articolele cu titluri provocatoare ca 'Complotul iudeo-masonic impotriva natiunii romane' sau 'Evreii si alcoolismul'. Din pricina atitudinii politice a lui Paulescu au avut loc in vara anului 2003 proteste impotriva dezvelirii unui bust al lui Paulescu la Spitalul 'Htel Dieu' din Paris. Profesorul Nicolae Cajal, in acel timp presedinte al Sectiei Medicale a Academiei Romane si presedinte al Comunitatii Evreiesti din Romania, i-a luat apararea lui Paulescu, sustinand: 'Personal nu impartasesc asemenea conceptii (opiniile ideologice ale lui Paulescu, n.n.), nu am cum, si intr-un fel, pentru mine, e dramatica aceasta situatie. Insa din acest motiv nu am voie sa neg meritele stiintifice reale ale lui Nicolae Paulescu, aportul sau cu totul deosebit la sanatate a oamenilor si cred ca nimeni nu are un asemenea drept'.
Politica de confidentialitate | Termeni si conditii de utilizare |
Vizualizari: 1476
Importanta:
Termeni si conditii de utilizare | Contact
© SCRIGROUP 2024 . All rights reserved