Imunoglobulinele mielomale si hibridomale sunt omogene

Imunoglobulinele mielomale si hibridomale sunt omogene

Cum este produs un anticorp specific inainte de a ajunge antigenul in contact cu celula producatoare?

Timp de multi ani, heterogenitatea preparatelor de anticorpi a fost un impediment in rezolvarea acestei probleme, datorita dificultatii analizei unui amestec de molecule de anticorpi. Acest obstacol a fost inlaturat prin utilizarea celulelor tumorale producatoare de anticorpi ale mielomului multiplu. In acest cancer, transformarea unei singure celule plasmatice (limfocit) va declansa o diviziune celulara necontrolata. Ca urmare, se vor produce celule de acelasi tip, in numar foarte mare. Ele se numesc clone pentru ca descind din aceeasi celula si au proprietati identice. Aceste tumori secreta cantitati mari de imunoglobuline de un singur tip. Ig mielomale au o structura normala si sunt tipic imunoglobuline, ele fiind un exemplu de Ig omogene, unul dintre tipurile de numerosi anticorpi prezenti intr-un organism animal.

Mielomul poate fi produs experimental si la soarece. Celulele tumorale pot fi transplantate la numerosi soareci in care ele vor prolifera. Mai mult: aceste celule vor sintetiza generatie dupa generatie, acelasi tip de anticorp (Ig mielomala).

Ig mielomale au condus la o descoperire majora in imunologia moleculara.Cezar Milstein si Georges Khler au decoperit ca prin fuzionarea unei celule producatoare de anticorp cu o celula mielomala se poate obtine o cantitate foarte mare de anticorp omogen de aproape orice specificitate dorita (Fig. 24).

In acest mod au fost produsi anticorpi monoclonali de foarte diferite tipuri, care sunt

utilizati acum ca reactivi analitici de mare specificitate. De exemplu, anticorpi monoclonali fata de un anumit medicament sau hormon pot fi utilizati pentru a detecta cantitati foarte mici de astfel de molecule din fluidele organismului.

Fiecare catena L si H are o regiune variabila si una constanta

De fapt sunt doar doua tipuri de catene L, denumite K (capa) si l (lambda) care difera in secventa aminoacida in proportie de 60%. Ambele tipuri au o punte disulfidica in capatul carboxilic al restului de cys cu lantul H si cate o punte disulfidica intracatenara.

Toate lanturile K au aceeasi secventa constanta (C) cu exceptia restului 191 care este ori leu ori val. Toate lanturile l au aceeasi secventa C cu exceptia restului 191 care este fie lys fie arg.

Lanturile H au 416 resturi aminoacide. Comparatia secventelor aminoacide din diferite imunoglobuline mielomale a aratat ca diferentele structurii primare sunt localizate in regiunea 1-108 a capatului aminic. Catena H, ca si cea L, are deci tot doua regiuni V si C. Regiunea V este de aceeasi lungime ca si cea a lantului L, in timp ce regiunea c este de aproape trei ori mai lunga.

Locul de legare cu antigenul se afla in zona variabila si este realizat de zonele hipervariabile ale catenelor H si L

Asa cum am mentionat fragmentul Fab este alcatuit din intreg lantul L si o parte din lantul H. care sunt contributiile relative ale celor doua catene (lanturi) la activitatea de legare?

Zonele V si C au roluri diferite

Capatul aminoterminal al catenelor de H si L contine regiunile variabile care sunt responsabile de legarea antigenului.Diferentele in secventa aminoacida rezulta in diferente de structura a locului de legare si implicit diferente de specificitate a anticorpilor.

Restul fiecarui lant contine regiunea constanta care mediaza functiile efectoare, cum ar fi legarea complementului si transferul anticorpilor prin membrana placentara. Anticorpii de specificitati f. diferite mediaza aceleasi functii efectoare. Cu alte cuvinte, anticorpii constau in regiuni de secventa unica (variabila) ce le confera specificitate de legare cu antigenul si in regiuni de secventa constanta, care mediaza functii efectoare comune.

O particularitate structurala marcanta a imunoglobulinelor este aceea ca regiunile V si C sunt demarcate net in secventele aminoacide ale ambelor tipuri L si H de catene.

Moleculele de anticorp sunt pliate in domenii compacte cu secvente omoloage

Secventa completa a moleculei de imunoglobulina a fost elucidata de Gerald Edelman in 1968. Trasatura cea mai interesanta a acestei secvente este localizarea periodica a legaturilor disulfidice intracatenare atat in catenele H cat si in cele L (Fig.27 )

Fig . 27 Secventa completa a moleculei de Ig

Mai mult, exista similitudini in secventa aminoacida a diferitelor parti ale moleculei de imunoglobulina. Regiunea variabila a lantului usor L(V_L) este omoloaga cu regiunea variabila a lantului greu (V_H). In plus, regiunea C_H consta in trei parti egale C_H1, C_H2, C_H3 care sunt similare in secventa, iar regiunea constanta a lantului usor C_L este omoloaga cu cele trei domenii ale regiunii constante ale lantului greu.

Omogenitatea evidenta a secventei aminoacide a sugerat ca imunoglobulinele sunt pliate in domenii compacte, fiecare constand intr-o regiune omoloaga continand cel putin un loc activ care serveste o functie moleculara distinctiva. (Fig. 28 )

Analiza cu raze x a locurilor de legare ale anticorpilor a relevat cum se leaga unele haptene

Asa cum a fost prevazut din compararea secventelor aminoacide si din studiile de afinitate, locul de combinare cu antigenul este format de resturile aminoacide din segmentele hipervariabile ale ambelor catene L si H.

Experientele de legare a unui derivat de vitamina K₁ si de fosforilcolina, au aratat ca haptena se leaga prin legaturi ionice, de hidrogen si Van der Waals intr-o cavitate formata in lanturile peptidice V_L si V_H.

Diferitele clase de imunoglobuline au activitati biologice distincte

Pana acum am discutat in amanunt despre structura si functiile biochimice ale IgG. De fapt exista cinci clase de imunoglobuline care difera prin structura lanturilor, masa moleculara si concentratia serica (Tab.4). Toate au lanturi L si H. Regiunile constante ale lanturilor H difera de la o clasa la alta, in timp ce lanturile L sunt ori l ori K. Lanturile grele in IgG sunt numite g, in Ig A, M, D, E sunt a m d e. Aceste cinci clase au diferite proprietati biologice. Asa cum am aratat la inceput IgM este prima clasa de anticorpi care apare in ser dupa injectarea antigenului, in timp ce IgG este principalul anticorp din ser. Mult timp IgG a fost denumita g globulina datorita proprietatilor ei electroforetice.

IgA este clasa majora de anticorpi din secretiile externe (saliva, lacrimi, mucus bronhic si intestinal). Astfel IgA serveste ca prima linie de aparare impotriva antigenilor bacterieni si virali.

Beneficiile oferite de IgD si IgE nu sunt cunoscute pana acum. Oricum efectele daunatoare ale imunoglobulinei E datorita medierii reactiilor alergice, sunt mai clar dovedite.

Tab.4

Clasele de Ig si proprietatile lor

Moleculele de anticorpi au aparut prin duplicarea si diversificarea genei

Asemanarile structurale intre domenii in imunoglobuline au implicatii evolutive importante.

Similitudinile secventei aminoacide in chimotripsina, tripsina, elastaza, trombina indica faptul ca ele au aparut dintr-un stramos comun.

In mod similar asemanarea structurii interne a imunoglobulinelor sugereaza ca anticorpii au aparut printr-un proces de duplicare si printr-o diversificare ulterioara a genelor.

O gena ancestrala este posibil sa fi codificat un anticorp primitiv avand o lungime de aproximativ 108 resturi aminoacide. Aceasta gena ancestrala s-a duplicat probabil si genele divergente rezultate au continut diferite tipuri de regiuni constante si variabile, care au dat nastere la tipuri corespunzatoare de lanturi polipeptidice.

Regiunile constante si variabile din Ig sunt codificate de gene separate care se unesc

Intrebarea a fost: cum sunt organizate si cum se exprima genele care codifica imunoglobulinele?

Asa cum am mentionat anterior, regiunile constante ale lanturilor kapa sunt identice, cu exceptia restului 191, care este fie leu fie val. Analizele de pedigree au aratat ca aceste doua variante (allotipuri) sunt mostenite intr-o maniera tipic mendeliana, ceea ce a sugerat cu pregnanta ca exista doar o singura gena pentru regiunea constanta a acestor lanturi.

Dimpotriva, analizele genetice au aratat ca regiunile variabile sunt codificate de mai multe gene. In 1976, S. Tonegawa a aratat ca genele multiple V si C sunt la distanta in ADN embrionar (linia germinativa) dar sunt strans asociate in AND-ul celulelor producatoare de anticorpi. Concluzia a fost ca genele asociate imunoglobulinelor sunt translocate in timpul diferentierii limfocitelor.

Teoria selectiei clonale in producerea de anticorpi

Un model unic al raspunsului imun este furnizat de teoria selectiei clonale formulata de Niels Jerne, Macfarlane Burnet, David Talmage si Joshua Lederberg in anii 1950.

Trasaturile esentiale ale teoriei sunt urmatoaarele:

O celula producatoare de anticorp are o secventa de baze unica in AND-ul sau care determina secventa de aa in lanturile sale de imunoglobuline. Specificitatea unui anticorp este determinata de secventa sa aminoacida.

O singura celula produce anticorpi de un singur tip. Capacitatea de a sintetiza anticorpi de un anumit tip este determinata inainte ca celula sa intalneasca antigenul.

Fiecare celula, pe masura ce incepe sa se maturizeze, produce cantitati mici de anticorpi specifici. O parte din anticorpii ei raman legati de suprafata celulei. O celula imatura este omorata daca intalneste antigenul corespunzator anticorpului ei. De aici rezulta ca un animal nu face in mod obisnuit anticorpi impotriva macromoleculelor sale - este deci autotolerant. Astfel de celule producatoare de anticorpi sunt eliminate in cursul vietii fetale. Dimpotriva, o celula matura este stimulata daca intalneste un antigen. Cantitati mari de anticorpi sunt sintetizate ulterior si sunt astfel declansate mecanismele de diviziune celulara. Descendentii acestei celule constituie o clona. Ei au acelasi substrat genetic ca si celula care a fost initial stimulata de contactul cu antigenul si de aceea toti descendentii ei produc anticorpi de aceeasi specificitate.

O clona tinde sa persiste dupa disparitia antigenului. Aceste celule retin capacitatea de a fi stimulate de antigen daca acesta reapare, ceea ce dovedeste existenta unei memorii imunologice.

O celula producatoare de anticorpi contine receptori pentru antigeni pe suprafata ei

Moleculele de anticorpi specifici sunt localizate pe suprafetele celulelor producatoare de anticorpi. Celulele precursoare sunt limfocitele, care se divid foarte incet daca nu sunt stimulate de antigen. Ele devin apoi celule plasmatice, care sunt foarte active in sinteza si secretia anticorpilor.

Cum sunt stimulate lifocitele la expunerea la un antigen specific? Moleculele de anticorp de pe suprafata limfocitelor sunt distribuite randomizat in absenta antigenului. Aditia antigenului are un efect surprinzator: moleculele de anticorp de suprafata cu antigenul lor legat se asociaza pentru a forma o calota. Consecutiv acestei redistributii, moleculele de anticorp de pe suprafata sunt invaginate in interiorul celulei. Formarea calotei este un proces energodependent care implica activitate contractila. Formarea unei retele anticorp-antigen de suprafata conduce la constituirea calotei, care la randul ei stimuleaza diviziunea celulara. Antigenul trebuie sa fie multivalent (sa constituie mai mult de un determinant) astfel incat sa lege incrucisat (cross-link) moleculele de anticorp pe suprafata limfocitului. Legatura dintre aceste evenimente moleculare la suprafata celulei si activitatea mitotica in nucleu este o arie de investigatie interesanta, promitatoare si inca neexploatata.

Semnificatia biologica a selectiei clonale

Esenta teoriei selectiei clonale este urmatoarea:

Nici un loc de combinare nu este, in sens evolutionar, adaptat la un determinant antigenic particular. Conformatia structurala a locului de legare este acolo si daca se intampla sa se potriveasca antigenului, in sensul ca afinitatea de adsorbtie pentru un determinant antigenic este deasupra unei anumite valori, va fi initiata o reactie imunologic semnificativa.

Selectia unei conformatii preexistente care este generata intamplator nu este o tema noua in biologie. Este, evident, esenta teoriei evolutioniste a lui Darwin. Este interesant totusi de notat ca teoriile instructive au precedat teoriile selective: teoria lui Lamarque inaintea celei a lui Darwin, plierea directionata antigenic (Pauling) inaintea selectiei clonale.

Jerne a sugerat ca trebuie considerata posibilitatea ca mecanismele de selectie sa joace un rol in operatiile sistemului nervos, asa cum este de exemplu memoria.

De fapt: teoria instructiva si selectiva a invatarii au fost enentate cu mult timp in urma. Locke a sustinut ca scoarta cerebrala poate fi asemanata cu o foaie de hartie alba (tabula rasa), lipsita de toate caracteristicile, pe care experienta deseneaza de o maniera variabila aproape la nesfarsit. In contrast, Socrate a afirmat ca " tot procesul de invatare consta in a se reaminti ceea ce este preexistent in creer".

Dilema exista, deci, de cand omenirea a devenit constienta de sine. Confirmarea uneia sau alteia din asertiuni este o chestiune de timp si se face treptat prin cunoasterea adevarurilor partiale care sunt fatete ale adevarului absolut -infinit si intangibil.