MATERIALUL SEMINAL - CONSERVAREA MATERIALULUI SEMINAL

EXAMENUL MATERIALULUI SEMINAL

este precedat si corelat intotdeauna cu examenul fizic general al reproducatorului mascul;

se urmaresc evaluarea caracterelor macroscopice (volum, culoare, miros, consistenta ejaculatului) si microscopice (desime, mobilitate, nr. spermatozoizilor/ml, % spermatozoizilor morti, imaturi si cu anomalii).

I.            EXAMENUL MACROSCOPIC

Volumul ejaculatului

se face imediat dupa recoltare prin citire directa in paharul de recoltare;

se poate aprecia volumul total al ejaculatului sau separate pentru fiecare fractiune in parte;

variaza in limite foarte largi in functie de: rasa, varsta, individ, stare de intretinere, frecventa ejacularilor, metoda de recoltare.

Culoarea ejaculatului

se apreciaza subiectiv imediat dupa recoltare prin examinarea probei in fata unei surse de lumina;

variaza in functie de specie, concentratia in spermatozoizi, secretiile glandelor anexe si prezenta substantelor straine in ejaculat (sange, puroi, urina, etc).

Mirosul ejaculatului

in mod normal sperma proaspat recoltata este inodora.

pH-ul spermei

se apreciaza cu ajutorul hartiei indicatoare de pH sau a pH-metrelor; in mod normal este cuprins intre 6,2-7,2 unitati pH.

Exista un raport intre densitatea si mobilitatea spermatozoizilor si pH-ul spermei in sensul ca, cu cat o proba de sperma este mai buna cu atat ea este mai acida.

II.         EXAMENUL MICROSCOPIC

Concentratia materialului seminal

numarul de cellule spermatice pe unitatea de volum (ml sau mm3); reprezinta un indicator important al calitatii materialului seminal si constituie punctual de plecare pentru stabilirea tehnologiei de conservare si a gradului de dilutie a materialului seminal;

2 tehnici de determinare: a) cu ajutorul hemocitometrului;

b) metoda computerizata.

a) metoda hemocitometrica este relative simpla, adaptata dupa tehnica de numarare a globulelor rosii.

Materiale necesare: - retea Burker, Burker-Turk;

- pipeta Potain;

- lamele;

- microscop;

- solutie clorura de sodium 3%.

Tehnica de lucru: - in pipeta Potain se aspira sperma proaspata pana la diviziunea 0 , apoi solutie de clorura de sodium pana la diviziunea 101 (dilutie 1:200), se agita bine. Se indeparteaza primele 2-3 picaturi apoi se depune o picatura pe camera de numarat, se acopera cu o lamella si se examineaza la microscop.

Se numara spermatozoizii din 80 de patratele mici, din 5 patrate mari.Se aleg in diagonala 4 patrate mari iar al 5-lea la intamplare.

Calcul:

NxSxIxD

C=────────── unde;

n

C - concentratia spermei;

N - numarul spermatozoizilor in 80 de patratele mici;

S - suprafata unui patratel (1/400 mm2);

I - inaltimea camerei capilare formate intre camera de numarat si lamela(1/10 mm);

D - gradul de dilutie a spermei (1:200);

n - numarul de patratele in care s-au numarat spermatozoizii.

Rezultatul exprima numarul de spermatozoizi in milioane/mm3 de sperma; pentru a afla concentratia pe ml cifra obtinuta se inmulteste cu 1000.

b) metoda electronica (SQA) este mult mai rapida si mai exacta.Rezultatul testelor este afisat atat pe ecranul aparatului cat si intr-un format printat (bulletin de analiza).

Mobilitatea spermatozoizilor

examenul vizeaza aprecierea: a) - mobilitatii generale a spermei;

b) - mobilitatea individuala a spermatozoidului.

a) - se apreciaza cat mai repede dupa recoltare, prin depunerea unei picaturi de sperma nediluatape o lama de microscop curat, degresata, incalzita la 37, examinata cu un obiectiv de putere mica (10x);

- mobilitatea generala a spermei se apreciaza pe o scara notata de la 0-5; lipsa de miscare se noteaza cu 0 in timp ce miscarea in val se noteaza cu 5;

- mobilitatea generala a spermei proaspete trebuie sa se incadreze intre 80-90%.

b) - se apreciaza prin examinarea unei picaturi de sperma proaspata diluata, depusa intre lama si lamela si examinata cu un obiectiv mare (40x);

- se va aprecia miscarea de inaintare, traiectoria de inaintare si viteza de inaintare. In mod normal deplasarea spermatozoizilor se realizeaza prin miscari ondulatorii ale cozii associate cu rotatii in jurul axului longitudinal, rezultand o miscare de inaintare rectilinie.

Mobilitatea individuala a spermatozoizilor se noteaza pe o scara de la 0-5 si se considera ca sperma normala se regaseste intre 2 -5.

Aprecierea morfologiei spermatozoizilor

ofera posibilitatea de a pune in evidenta spermatozoizii imaturi, cu anomalii sau morti.

se apreciaza imediat dupa recoltare prin examen microscopic (100x cu imersie) dupa colorare prealabila (albastru de metilen, violet de gentiana, tus de China, opal-blau, abastru-tripan Giemsa, eozina-negrozina).

Coloratia cu eozina-negrozina este o metoda de colorare intravitala, de excludere; eozina este eliminata din spermatozoizii vii cu membranele de plasma intacte, iar in cazul spermatozoizilor cu membrane alterate (morti/pe cale de a muri) retin eozina si se coloreaza in rosu.Negrozina realizeaza o coloratie de fond destinata delimitarii conturului celular.

Tehnica de lucru: - se amesteca 9 parti negrozina sol 10% in apa distilata, cu 1 parte eozina sol 5% in apa distilata. Din acest amestec se ia 1 picatura si se adauga peste 1 picatura de sperma, se omogenizeaza si se fac frotiuri cat mai subtiri pe o lama de microscop bine degresata, se usuca si se examineaza.

Din punct de vedere morphologic spermatozoizii pot fi incadrati in 3 grupe: normali, cu anomalii majore (primare), cu anomalii minore (secundare).

Calcul:

nx100

X=─────── unde

500

n - numarul spermatozoizilor patologici (se numara 500 celule spermatice).

Intr-un ejaculat normal procentrul spermatozoizilor anormali, imaturi sau morti nu trebuie sa depaseasca 20%.

III.       EXAMENE COMPLEMENTARE

Testul hipoosmotic

permite aprecieri privind integritatea membranei spermatozoidului; testul utilizeaza o solutie hipotonica si permite aprecieri legate de capacitatea de transport a fluidelor prin traversal membranei.

Tehnica de lucru: - 0,1 ml sperma din fractiunea spermatica se pun in contact cu 1 ml solutie hipoosmotica, apoi se incubeaza timp de 30 minute la 37 C. Se omogenizeaza ,se depun intr-o camera de numarare a spermatozoizilor si se examineaza la microscop in contrast de faza.

In prezenta mediului hipoosmotic spermatozoizii normali sufera leziuni prin gonflarea membranei din zona piesei intermediare si/sau a celei din regiunea cozii.La spermatozoizii cu defecte de membrane nu se constata balonari.

Utilitatea acestui test se regaseste in mecanismele de deshidratare ce intervin in momentul congelarii spermei.

Proba redox (testul cu albastru de metilen)

se bazeaza pe principiul masurarii capacitatii de reducere a celulelor spermatice prin intermediul unei substante colorante (albastru de metilen);

hidrogenul rezultat in urma actiunii dehidrogenazelor asupra glucozei din sperma este acceptat de albastru de metilen , care la hidratare se transforma intr-un leucoderivat decolorand solutia.

cu cat este mai rapida decolorarea amestecului de sperma cu albastru de metilen cu atat proba de sperma este mai buna.

IV.      EXAMENE SPECIALE

Examenul bacteriologic

presupune recoltarea separata a fractiunilor ejaculatului, in conditii de sterilitate;

se vor face insamantari pe medii pentru germeni aerobi, anaerobi, micoplasme sau ureaplasme si pentru fungi;

in sperma in mod normal se gasesc aproximativ 10.000 celule bacteriene/ml.

Examenul immunologic

urmareste detectarea anticorpilor antispermatici, care determina alterarea capacitatii fecundante a spermatozoizilor;

sinteza anticorpilor antispermatici se realizeaza de catre propriul sistem imun in momentul in care spermatozoizii vin in contact cu sangele circulant.

DILUAREA SI CONSERVAREA MATERIALULUI SEMINAL

1. Mediile de dilutie

- sunt solutii de diferite saruri anorganice sau organice, cu sau fara adaosuri de fermenti, vitamine, macro si microelemente, cu o compozitie chimica si constante fizice asemanatoare cu sperma speciei respective.

- pentru a putea indeplini rolul de medii protectoare pentru spermatozoizi, mediile de dilutie trebuie sa contina:

a) substante energetice (zaharuri);

b) substante care sa previna sis a protejeze sperma impotriva socului termic (lecitina din galbenusul de ou);

c) substante tampon care sa mentina constant pH-ul spermei in timpul conservarii (citrate, fosfati, tartrati, etc);

d) substante care activeaza mobilitatea spermatozoizilor in caile genitale (mucinaza);

e) substante care impiedica dezvoltarea florei microbiene (sulfamide, antibiotice).

2. Prelucrarea materialului seminal in paiete la temperature camerei cu echilibrare termica si glicerinica in camera frigorifica

dupa examinarea macroscopica si microscopica si dupa determinarea principalilor indicatori spermatici, materialul seminal se dilueaza respectandu-se urmatoarele etape:

a)      dilutia initiala 1:1

b)      dilutia VT/2

c)      dilutia finala (glicerinarea)

a) Dilutia initiala 1:1 - se realizeaza imediat dupa prelucrarea ejaculatului, cu diluant fractiunea "A" (cu 3% glicerina), la temperature de 37 C; dilutia se poate realize direct in paharul de recoltare (ejaculate cu volum mic), sau in sticle de dilutie cu peretii dublii.

- ejaculatele diluate 1:1 se mentin la temperature camerei timp de 7-8 minute, iar pe recipiente se inscriu urmatoarele elemente: numarul ejaculatului, numele taurului, VT/2 si ora efectuarii lui, VT si ora efectuarii lui.

b) Dilutia VT/2 - se efectueaza cu diluant fractiunea "A" (contine 3% glicerina), la 7-8 minute dupa efectuarea dilutiei 1:1; diluantul fractiunea "A" cu care se efectueaza dilutia VT/2 trebuie pastrat la temperature de 30 C intr-o baie de apa controlata termic.

- dupa efectuarea dilutiei VT/2 sticlele vor fi acoperite cu dopuri sterilizate.

c) Dilutia finala (VT-glicerinarea) - se efectueaza cu diluant fractiunea "B" (contine 11% glicerina), in 2 etape; prima etapa dupa 10 min. de la efectuarea dilutiei VT/2 iar a doua etapa dupa 7 minute.

- diluantul fractiunea "B" cu care se executa glicerinarea se pastreaza la temperature de 20 C.

Impaietarea materialului seminal

se utilizeaza paiete confectionate din policlorura de vinil cu capacitatea de 0,5 ml (paiete mijlocii) sau 0,25 ml (paiete mici).

Pe fiecare paiete se imprima urmatoarele date: numarul de cod, numele animalului, rasa, unitatea producatoare, data recoltarii.

Formarea bulei de aer

dupa umplerea paietelor cu material seminal diluat, la capatul care se va inchide cu dopul de laborator este necesara crearea unei bule de aer care sa permita dilatarea coloanei de material seminal in timpul congelarii;

bula de aer se poate confectiona cu ajutorul barchetelor sau in lipsa acestora prin scuturarea energica a paietei.

Formarea dopului de laborator

se realizeaza cu ajutorul pudrei de alcool polivinilic ; dupa introducerea pudrei in lumenul paietei (4-5 mm) capatul paietei se va introduce in apa prin aceasta operatiune realizandu-se polimerizarea alcoolului polivinilic si formarea gelului care etanseizeaza paieta.

Echilibrarea materialului seminal

paietele se dispun pe rampe metalice si se introduce in camera frigorifica la temperature de 2-4 C unde se mentin minim 3 .

Congelarea materialului echilibrat termic si glicerinic

se realizeaza in containare de mare capacitate cu gura larga; inainte de inceperea operatiunii de congelare se procedeaza la:

verificarea nivelului de azot lichid

verificarea temperaturii la nivelul paietelor asezate pe rampele de congelare

paietele mijlocii se congeleaza in vapori de azot lichid la -160 C cu un timp de expunere de 7 min, iar paietele fine se congeleaza la -130 C dupa un timp de expunere de 9 min.

dupa expirarea timpului de expunere paietele se scufunda in azot lichid.