Abordarea experimentala a celulei

Abordarea experimentala a celulei

I. Modelarea experimentala a fenomenelor celulare

II. Tehnici si metode de urmarire a fenomenelor celulare

I.            1) experimentul in vivo;

2) experimentul in situ;

3) experimentul in vitro;

- baie de organ;

- in cultura;

Etapele obtinerii unei culturi de celule

digestia enzimatica a tesutului;

izolarea unei populatii celulare;

insamantarea in flacoane de cultura sau placi Ptri (cultura primara);

pasarea (cult. sec.) = resuspendarea celulei din cult. Primara urmata de insamantarea in alt mediu;

Evolutia un ei culturi de celule

faza de lag.;

faza exponentiala;

faza stationara;

faza de declin;

Mediile de cultura

aminoacizi;

vitamine;

saruri;

glucoza;

Tehnici si metode de urmarire a fenomenelor celulare

citometrie in flux;

fractionare celulara;

morfologie si morfometrie;

citochimie si citoenzimologie;

imunocitochimie;

fluorescenta, imunofluorescenta;

microfiziologie, microinjectie;

radioantografie;

metode biochimice;

10) tehnici si metode de biologie moleculara;

Ce informatii se obtin despre celula?

Marimea relativa;

Granularitatea (neomogenitatea);

- Aparatul utilizat - un sistem optico-electronic care inregistreaza interactiunea celulei cu un fascicul laser coerent si de mare intensitate. Informatiile preluate pe computerul citometrului sunt obtinute sub forma unor grafice (histograma) si a unor reprezentari prin puncte.

- Una din performantele citometriei in flux = posibilitatea separarii populatiilor de celule.

Citometria in flux

Analiza rapida de rutina 500 - 4000 celule / secunda.

Numarul total al celulelor analizate: mare, permite evaluari statistice.

domeniul de utilizare:

- biologia celulara;

- imunologie;

- oncologie;

- reumatologie;

- genetica;

- prin:

- masurarea caracterelor fizice ale celulelor;

- identificarea si separarea subpopulatiilor de celule sangvine (granulocite, monocite, limfocite T si B);

- masurarea cantitativa de ADN din celula;

- masurarea concentratiei intracelulare a calciului;

- masurarea pH - ului intracelular;

Fract. cel.:

omogenizare;

separare prin centrifugare;

Omogenizarea

prin soc osmotic;

prin ultrasonicare;

cu omogenizatoare;

Separarea

centrifugare diferentiala;

centrifugare in gradient de densitate: - continuu;

- in trepte;

Autoradiografie

permite localizarea unor compusi radioactivi;

Electroforeza unidimensionala

SDS - page;

Focalizarea izoelectrica;

Electroforeza bidimensionala

Prima dim.:

- focalizare izoelectrica;

A doua dim.:

- SDS - page;

Imunoelectroforeza;

Transfer electroforetic;

Cromatografie;

Tipuri de cromatografie:

In strat subtire;

In faza lichida;

In faza gazoasa;

Metode cromatografice:

Gel - filtrare;

Prin schimb ionic;

Prin interactiune hidrofoba;

Cu faze inversate;

Cu faze normale;

Prin afinitate;