MIJLOACE DE IDENTIFICARE A BACTERIILOR

Identificarea genurilor si speciilor bacteriene se face pe baza examinarii urmatoarelor grupe de caractere:

caractere morfologice si tinctoriale;

conditii de cultivare si caractere culturale;

caractere biochimice;

caractere antigenice;

caractere de patogenitate.

1. Examenul caracterelor morfologice si tinctoriale

Examinarea bacteriilor, data fiind dimensiunile lor, se poate realiza numai cu ajutorul microscoapelor. In vederea examenului microscopic se pot folosi preparate native (practica mai rar folosita), sau frotiuri fixate si colorate dupa tehnici specifice bacteriologice (practica folosita in mod curent).

In toate cazurile in procesul examenului microscopic se va folosi obiectivul de imersie, procedandu-se astfel:

- se fixeaza frotiul pe platina (masa) microscopului, cu partea etalata in dreptul lentilei frontale a obiectivului;

- se ridica condensatorul la maxim;

- se depune o picatura de ulei de cedru pe frotiu;

- se coboara, incet, tubul microscopului, cu ajutorul vizei macrometrice, privind lateral, pana cand obiectivul de imersie se cufunda in uleiul de cedru de pe lama;

- se priveste prin ocular si se ridica incet viza macrometrica pana apare imaginea;

- se regleaza imaginea cu ajutorul vizei micrometrice.

1.1.Examenul preparatelor in stare nativa

Se realizeaza din preparate umede, cu germeni vii, intre lama si lamela, se examineaza in lumina directa sau in camp intunecat.

Tehnica de lucru:

Pe o lama de sticla se pune o picatura dintr-o cultura bacteriana in mediu lichid, sau se executa o suspensie in ser fiziologic din germenii raclati cu ansa bacteriologica dintr-o cultura pe mediu solid si se acopera cu o lamela. Se examineaza la microscop in lumina directa sau in camp intunecat, utilizand microscopul cu condensator cardioid.

Examenul se poate executa si in picatura suspendata, cand pe o lama se pune picatura din cultura bacteriana lichida sau suspensia de germeni in ser fiziologic de pe mediul solid, iar printr-o miscare rapida se rastoarna deasupra unei lame cu godeu.

Aceasta metoda permite observarea mobilitatii bacteriilor, a formei si a dimensiunilor lor.

1.2. Examenul microscopic al bacteriilor in frotiuri

Examenul microscopic curent al bacteriilor se face pe frotiuri fixate si colorate. Prin frotiu se intelege o lama de sticla pe care se afla etalat intr-un strat fin si uniform materialul patologic sau cultura bacteriana.

Tehnica efectuarii frotiului

In executarea unui frotiu se parcurg obligatoriu urmatoarele etape: curatirea si. degresarea lamelor, etalarea materialului de examinat, uscarea, fixarea si colorarea.

- Curatirea si degresarea lamelor

Lamele se curata prin fierbere in apa usor saponata, sau cu adaus de detergenti. Degresarea se poate face fie prin tinerea lamelor curate intr-un vas cu alcool, fie prin flambarea suprafetelor lamei, inainte de intrebuintare, respectiv trecerea de mai multe ori prin flacara becului de gaz.

- Etalarea

Consta in aplicarea materialului de examinat pe lama, intr-un strat fin si uniform, fara sa se atinga marginile lamei. Modul de etalare difera cu scopul urmarit si cu natura materialului patologic (tabelul 1).

Tabelul 1 Tehnici de etalare

- Uscarea

Dupa etalare lamele se lasa sa se usuce la temperatura camerei, pe dispozitivul de uscat lame. Uscarea se poate grabi prin tinerea lamei deasupra becului de gaz.

- Fixarea

Urmareste o aderare mai intensa a materialului patologic pe lama si totodata inactivarea germenilor. Fixarea se poate realiza prin urmatoarele procedee:

fixarea prin caldura - frotiul uscat se trece de cateva ori prin flacara unui bec de gaz, cu fata opusa celei pe care este etalat materialul patologic;

fixarea prin alcool flambare - se acopera frotiul cu alcool etilic sau metilic si se aprinde;

fixarea cu lichide fixatoare (alcool etilic, amestec alcool etilic si eter), se acopera frotiul cu unul dintre aceste lichide si se lasa sa se evapore.

- Colorarea

In bacteriologie sunt larg folositi coloranti bazici ca: albastrul de metilen; fuxina bazica, violetul de gentiana; cristalul violet etc. Fenomenul de colorare este conditionat si determinat in primul rand de structura chimica diferita de la un grup de bacterii la altul, sau chiar de la o specie la alte. Asa se explica comportarea diferita a unor specii bacteriene fata de acelasi colorant sau procedeul de colorare.

1. Metode de colorare

Prin colorare se pot stabili unele particularitati morfologice ale germenilor (dimensiuni, forma, mod de grupare, afinitati tinctoriale), precum si relatiile in care se afla cu tesuturile; facilitandu-se astfel precizarea diagnosticului.

Metodele de colorare sunt diverse si se aplica in mod diferentiat in functie de scopul urmarit. Exista metode care se aplica in mod curent (uzuale) si metode mai pretentioase, aplicate numai in anumite situatii (speciale).

Metode uzuale de colorare

Metoda de colorare cu albastru de metilen

Se utilizeaza solutia alcalina de albastru de metilen 1%. ,

Tehnica de lucru:

Frotiul uscat; fixat si racit se acopera cu solutia de albastru de metilen, se lasa in contact 2 - 4 minute; se spala cu apa de robinet; se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: formele vegetative ale bacteriilor apar colorate in albastru uniform, capsula apare colorata in roz-pal, iar sporii se evidentiaza ca o vacuola necolorata. In frotiurile din organe, tesuturile sunt colorate in albastru-pal, iar nucleii celulari in albastru intens.

Metoda de colorare cu fucsina Ziehl diluata 1 / 10

Se executa identic cu metoda precedenta.

Interpretare: Bacteriile apar colorate in rosu.

Metoda de colorare Gram

Pentru executarea coloratiei se folosesc urmatoarele solutii (acestea se afla in permanenta pe masa de lucru; in sticle de culoare inchisa, dispuse intr-un stativ de lemn, constituind 'bateria de coloranti si reactivi' - fig. 13):

- solutie de violet de gentiana 1%;

- solutie Lugol (sol. mordanta);

- solutie de alcool acetona (sol. decoloranta);

- solutie de fucsina Ziehl diluata.

Fig. 1 Baterie de coloranti

Tehnica de lucru:

Frotiul uscat, fixat si racit se trateaza astfel:

- se acopera frotiul cu solutie de violet de gentiana, timp de 1 - 2 minute;

- se inlatura colorantul, se spata frotiul cu apa de robinet si se acopera cu sol. Lugol. timp de 1 - 2 minute;

- se inlatura sol. Lugol si se decoloreaza cu solutie de alcool - acetona (se aplica pe frotiu 2 - 3 picaturi si se fac miscari de inclinare, 15 - 30 secunde, dupa grosimea frotiului), iar apoi se spala cu apa de robinet;

- se acopera frotiul cu sol. de fucsina diluata 1 / 10, timp de 1 - 2 minute, se spala cu apa de robinet; se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: bacteriile Gram pozitive apar colorate in albastru violet, pentru ca fixeaza puternic primul colorant, pe care nu-I pierd in cursul operatiei de decolorare. Bacteriile Gram negative apar colorate in rosu, pentru ca sub actiunea solutiei de alcool - acetona pierd violetul de gentiana si sunt recolorate ulterior cu solutia de fucsina diluata. Capacitatea de a retine sau nu violetul de gentiana sub actiunea alcool - acetonei are la baza procese fizico - chimice conditionate de particularitatile morfo-structurale si chimice ale peretelui bacterian.

Mentionam ca se pot gasi, in mod natural, celule cu proprietati intermediare; numite Gram labile. De asemenea, Gram pozitivitatea este influentata si de varsta germenilor, celulele batrane adeseori o pierd, din Gram pozitive devenind gram negative.

Metoda de colorare Ziehl Neelsen

Se foloseste pentru colorarea bacteriilor acido - alcoolo - rezistente (bacilii tuberculozei; paratuberculozei; leprei etc.). Pentru executarea coloratiei sunt necesare urmatoarele solutii:

- solutia de fucsina fenicata Ziehl;

- solutia decoloranta de alcool-acetona;

- solutia de albastru de metilen.

Tehnica de lucru:

Frotiul uscat; fixat si racit se trateaza astfel:

- se acopera cu solutia de fucsina Ziehl fenicata si se incalzeste usor pana la emisie de vapori, timp de 5 minute (incalzirea se realizeaza cu un tampon de vata fixat pe o tija metalica, imbibat in alcool); evitand fierberea colorantului pe lama;

- se decoloreaza frotiul prin spalare cu solutie de acid azotic 1 / 3 sau acid sulfuric diluat 1 / 4, timp de 30 - 60 secunde, in functie de grosimea frotiului;

- se spala frotiul cu apa de robinet; pentru indepartarea solutiei decolorante si se acopera cu solutie de albastru de metilen, timp de 1 minut;

- se inlatura colorantul, se spala frotiul cu apa de robinet, se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: bacilii acido - alcoolo - rezistenti apar colorati in rosu, deoarece prin decolorare nu pierd fucsina, iar restul germenilor (neacido - alcoolo - rezistenti) si fondul frotiului (resturi tisulare si celulare), apar colorati in albastru.

Metoda de colorare selectiva cu fucsina este recomandata de catre O.M.S., pentru colorarea brucelelor din materialele patologice.

Solutiile necesare sunt:

- solutie de fucsina diluata 1 / 10;

- solutie de acid acetic 0,5%;

- solutie de albastru de metilen 1%.

Tehnica de lucru:

Se acopera frotiul cu solutia de fucsina diluata si se lasa timp de un minut, se face diferentierea timp de 30 secunde cu solutie de acid acetic, se spala frotiul prin acoperirea lamei cu apa distilata, timp de 1 - 3 minute; se coloreaza cu albastru de metilen, timp de 30 secunde, se spala cu apa distilata, se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: germenii din genul Brucella se coloreaza in rosu aprins, iar germenii apartinand altor genuri se coloreaza in albastru.

Metoda de colorare Stamp, pentru rickettsii.

Solutiile necesare sunt:

- solutia de fucsina Ziehl (diluata     1 / 5);

- solutie de acid sulfuric 0,05%;

- solutie apoasa de verde de malachit 2%.

Tehnica de lucru: Frotiul uscat, fixat si racit se trateaza astfel:

- se acopera cu solutia de fucsina diluata 1 / 5, timp de 8 - 10 minute;

- se varsa colorantul, se spala cu apa de robinet si se decoloreaza    prin introducerea pentru 2 - 3 secunde intr-un pahar cu acid sulfuric 0,05%;

- se spala cu apa de robinet si se coloreaza 20 - 40 secunde cu solutie verde de malachit;

- se spala cu apa de robinet; se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: rickettsiile apar colorate in rosu intens, iar restul germenilor, precum si fondul frotiului (celule, proteine tisulare) se coloreaza in verde pal.

Metoda de colorare Tribondeau - Fontana
Se foloseste pentru colorarea leptospirelor si consta in impregnarea argentica.
Sunt necesare urmatoarele solutii:
- Solutia Ruge:

- formol 2,0 ml;
- acid acetic glacial 1,0 ml;
- apa distilata 100 ml.
- Solutia mordanta:

- acid tanic 5,0 g;
- fenol 1,0 g;

- apa distilata 100 ml

- Solutia argentica Fontana:

- azotat de argint 5,0 g;

- apa distilata 100 ml.

La 80 ml din solutia argentica Fontana se adauga, picatura cu picatura, solutie concentrata de amoniac. Se formeaza un precipitat brun, dens. Se adauga amoniac in continuare pana ce precipitatul se dizolva si amestecul devine limpede. La acest amestec se adauga, tot picatura cu picatura, solutie azotat de argint 5%, pana cand devine usor opalescent. Astfel pregatita, solutia poate fi pastrata 1 - 2 luni.

Tehnica de colorare:

- frotiul uscat se acopera cu solutie Ruge (fixare), timp de 5 minute; se repeta fixarea de 2 - 3 ori;

- spalare cu alcool;

- se acopera lama cu solutie mordanta si se incalzeste pana la aparitia vaporilor, timp de 20 - 30 secunde (frotiul trebuie sa ia aspect metalic brun, se poate repeta impregnarea de 2 - 3 ori;

- spalare cu apa distilata;

- uscare;

- examinare la microscop, cu obiectivul cu imersie.

Interpretare: leptospirele apar colorate in brun - negru, iar fondul in galben.

IV. Evidentierea particularitatilor morfologice ale bacteriilor

Particularitatile morfologice ale bacteriilor sunt reprezentate de cili, capsula, spori bacterieni si constituie criterii importante de identificare, in vederea apartenentei la specie a bacteriilor.

Evidentierea capsulei bacteriene

Capsula bacteriana este un invelis exterior al bacteriei de grosimi variabile, secretat de peretele celular. Consistenta capsulei este variabila, in general putin dura, cu structura chimica specifica si importante functii patogene. Poate fi evidentiata prin diferite metode de colorare, deoarece are proprietatea de a se colora diferit de restul celulei bacteriene.

Metoda de colorare Giemsa

Colorarea se face cu solutie Giemsa, care se gaseste gata preparata in comert.

Tehnica de lucru:

Frotiul uscat, dar nefixat, se acopera cu solutie Giemsa, in strat subtire, numarand picaturile care se depun pe lama. Dupa 30 - 60 secunde se adauga, pentru fiecare picatura de colorant, 2 - 4 picaturi de apa distilata. Se lasa un timp de.3 -5 minute, apoi se varsa, se spala bine, se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: capsula se coloreaza in diferite nuante de roz-violet, iar corpul bacterian in albastru violet.

Metoda de colorare cu albastru de toluidina:

Frotiul uscat, fixat si racit, se acopera cu solutie de albastru de toluidina, timp de 1 - 2 minute, se varsa, se spala, se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: capsula se coloreaza in roz, iar corpul bacterian in albastru.

Metoda de colorare cu albastru de metilen.

Tehnica de lucru:

Frotiul fixat si racit se acopera cu solutie de albastru de metilen, timp de 2 - 5 minute, se varsa, se spala si se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: capsula se coloreaza in roz pal, iar corpul bacterian in albastru uniform.

Metoda de colorare cu tus de China, pentru evidentierea capsulei. Solutii necesare:

- tus de China;

- albastru de metilen (solutie apoasa 0,5%)

- glucoza 6%.

Tehnica de lucru:

Pe o lama degresata se face o suspensie de germeni in ser fiziologic, se adauga, o picatura de solutie de glucoza 6% si o picatura de tus de China, omogenizandu-se bine. Din amestec se fac apoi frotiuri cu ajutorul unei lame slefuite sau cu ansa bacteriologica.

Dupa uscare, frotiul se fixeaza, acoperindu-l timp de 15 minute cu alcool metilic, se usuca si se coloreaza timp de 2 minute cu solutie de albastru de metilen. Se varsa colorantul, se spala cu apa de robinet, se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: capsula apare ca un spatiu clar, colorat in violet, iar bacteriile si fondul frotiului apar colorate in negru - cenusiu.

Evidentierea sporului bacterian

Sporul bacterian constituie o forma de conservare a speciei bacteriene. Sporogeneza este caracteristica numai bacteriilor din familia Bacillaceae (genul Bacillus si genul Clostridium) Forma, dimensiunile si asezarea sporilor in celula bacteriana, in raport cu forma vegetativa, constituie criterii importante de identificare. Sporii pot fi dispusi in cadrul formei vegetative central sau subterminal, cu diametrul mai mic decat al formei vegetative (genul Bacillus); sau pot fi situati central; subterminal sau terminal in cadrul formei vegetative, avand diametrul mai mare decat grosimea acesteia (genul Clostridium). Evidentierea sporilor se poate realiza atat prin metode de colorare, cat si prin metode indirecte (de incalzire).

A.     Metode de colorare pentru evidentierea sporilor

Pentru colorarea sporilor se folosesc metode energice de colorare, deoarece structura chimica a peretelui acestora nu permite patrunderea facila a colorantilor. Din acest motiv, prin colorarea sporilor prin metode uzuale, acestia apar ca niste vacuole necolorate.

Metoda de colorare cu verde de malachit

Solutii necesare:

- verde de malachit 5%;

- safranina 0,5% sau fucsina diluata 1 / 10.

Tehnica de lucru:

Frotiul uscat si fixat la flacara se acopera cu solutie de verde de malachit 5% si se incalzeste usor, timp de 3 minute, complectandu-se colorantul pe masura ce se evapora. Se spala frotiul cu apa de robinet si se acopera lama cu solutie de fucsina Ziehl diluata 1 / 10, timp de 1 minut, apoi se spala cu apa de robinet, se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: sporii apar colorati in verde, iar formele vegetative in rosu.

Metoda de colorare Moller

Solutii necesare:

- alcool absolut;

- acid osmic;

- acid azotic;

- albastru de metilen 1%.

Tehnica de lucru:

Frotiul uscat se fixeaza cu alcool absolut, timp de 2 minute, se trateaza apoi 5 minute cu vapori de acid osmic, se spala cu apa de robinet, se acopera cu fucsina Ziehl si se incalzeste pana la emisie de vapori de trei ori consecutiv. Se decoloreaza cu solutie de acid azotic 1 / 4, timp de cateva secunde, se spala cu apa de robinet, se recoloreaza cu albastru de metilen 1% timp de 2 minute; se spala cu apa de robinet, se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Interpretare: sporii apar colorati in rosu, iar bacteriile in albastru.

B. Metode indirecte de evidentiere a sporilor

Aceste metode se utilizeaza in cazul unor materiale patologice (continutul intestinal), sau a unor probe din mediul ambiant (sol, apa etc.), in care sporii sunt in cantitate mai mica, prezenta lor putand trece neobservata la examenul microscopic. Ca principiu, aceste metode au la baza proprietatea sporilor de a rezista la temperaturi mai mari decat formele vegetative.

Tehnica de lucru: materialul de examinat se supune incalzirii intr-o baie de apa la 65C, timp de 15 minute (pentru speciile genului Clostridium). Aceste temperaturi, distrug formele vegetative, dar nu si sporii. Dupa incalzire se fac insamantari pe medii de cultura convenabile speciei ce urmeaza a fi izolata.

Interpretare: sporii prezenti in materialul patologic germineaza in mediile de cultura incubate la 37C si dezvolta culturi, care se pot examina pe frotiuri colorate prin metode simple de colorare.

Evidentierea cililor bacterieni

Organite de miscare, cilii reprezinta in general un caracter de specie. Numarul si asezarea lor sunt caracteristice, constituind, la randul lor, criterii de identificare. Evidentierea cililor se poate face fie prin metode directe, fie prin metode indirecte (prin cultivare), iar examinarea mobilitatii se realizeaza pe preparate native.

A. Metode directe (de colorare)

Metoda de colorare Cesares Gill.

Foloseste fucsina Ziehl si o solutie mordanta. Solutia mordanta se prepara prin mojararea a 10 g tanin si 18 g clorura de aluminiu lichida in 33 ml alcool de 70. Intr-un alt mojar se dizolva 10 g clorura de zinc si 1,5 g fucsina bazica in 10 ml apa distilata. Cele doua solutii se amesteca varsand picatura cu picatura cea de a doua solutie in prima. Pastrarea solutiei se poate face la intuneric si rece, vreme indelungata.

In vederea colorarii, pe o lama bine degresata se pune o picatura de ser fiziologic, in care urmeaza sa se faca suspensia de germeni, cu miscari foarte lente, data fiind fragilitatea deosebita a cililor, care se desprind cu usurinta. Dupa uscare la aer se obtine frotiul propriu - zis. Pentru obtinerea unor imagini mai clare se poate recurge la suspensionarea prealabila a germenilor in apa distilata si tinerea la 37C, timp de 2 ore, din suspensia respectiva efectuandu-se frotiul.

Frotiul se acopera cu solutia mordanta, diluata 1 / 5 (o parte mordant la 4 parti de apa distilata) si filtrata extemporaneu. Solutia se tine pe lama pana la aparitia unui luciu metalic, dupa care se varsa. Se pune apoi fucsina Ziehl, care se lasa sa actioneze 1 - 2 minute, se varsa, se spala cu apa de robinet, se usuca in hartie de filtru si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie.

Corpii bacterieni apar colorati in rosu, iar cilii in roz pal.

B. Metode indirecte

1. Examenul microscopic al mobilitatii

Se executa in preparat nativ (intre lama si lamela) din cultura de cercetat si se examineaza la microscop, bacteriile se misca pe distante mari, traversand campul microscopic in multiple sensuri. Se va face diferentierea de alte tipuri de miscari precum miscarile bacteriei (miscari pe loc, cu aspect de tremurat) si miscarile curentilor de lichid (in acelasi sens), datorate compresiunii lamei sau pozitiei inclinate a lamei.

2. Determinarea mobilitatii prin metode de cultivare

a. Metoda insamantarii germenilor in lichid

Tehnica de lucru:

Se executa insamantarea germenilor cu ansa bacteriologica intr-un tub de geloza inclinata, in lichidul de condens, si se incubeaza la 37C, timp de 24 ore. Interpretare: speciile bacteriene imobile se dezvolta doar la fundul tubului, pe cand speciile bacteriene mobile invadeaza mediul pe intreaga suprafata. Fenomenul poarta numele de catarare si este prezent la speciile foarte mobile (genul Proteus si unele specii de Bacillus).

b. Metoda cultivarii in medii semilichide

Tehnica de lucru:

Se insamanteaza cu acul de insamantare un mediu semisolid (geloza moale, manita mobilitate) repartizat in tuburi in coloana dreapta, care se incubeaza la 37C, timp de 24 ore.

Interpretare: bacteriile mobile se dezvolta in toata masa mediului opacifiindu-I uniform, pe cand bacteriile imobile se dezvolta numai pe linia de insamantare.

Metoda tubului in 'U'

Tehnica de lucru:

Se indoaie un tub de teava fuzibila in forma literei U, se repartizeaza geloza moale si se sterilizeaza prin autoclavare. Se insamanteaza germenii cu ansa bacteriologica, intr-una din ramuri si se incubeaza la 37C, timp de 24 ore.

Interpretare: speciile imobile se dezvolta numai in ramura in care s-a efectuat insamantarea, in timp ce speciile mobile se dezvolta in toata masa mediului, inclusiv in ramura neinsamantata. Acest fenomen poarta denumirea de transmigratie .

4.1. Determinarea dimensiunilor la bacterii

Poate fi realizata, cu oarecare aproximatie, prin comparatie cu diferite elemente avand dimensiuni cunoscute, sau folosindu-se metode micrometrice.

Metoda comparatiei

Foloseste in special elementele eritrocitare, al caror diametru este in general de 7,7 - 8 microni. In acest scop se amesteca o suspensie bacteriana in ser fiziologic cu o picatura de sange. Din amestec se face un frotiu care se coloreaza si se examineaza la microscop, cu obiectivul de imersie. Metoda are doar o valoare orientativa.

Metoda micrometrica

Permite aprecieri mai exacte si foloseste dispozitive speciale din sticla, pe care sunt gravate scari gradate si care se adapteaza la microscop (micrometru ocular, montat sub lentila superioara a ocularului si micrometrul obiectiv, asezat pe platina microscopului). Micrometrul obiectiv se regleaza astfel incat liniile din dreptul cifrelor zero ale celor doua micrometre sa se suprapuna. Apoi se noteaza care din diviziunile celelalte se suprapun. Valoarea gasita la micrometrul obiectiv se inmulteste cu 10 (valoare in microni a unei diviziuni) si se imparte la valoarea de pe scara micrometrului ocular, obtinandu-se valoarea in microni a unei diviziuni de pe micrometrul ocular, cu care se fac apoi determinarile. Micrometrul obiectiv se scoate de pe platina microscopului si se pune pe preparatul de examinat. Numarul de diviziuni ocupat de formatiunea bacteriana sau celulara ce urmeaza sa fie determinata se inmulteste cu cifra corespunzatoare valorii in microni a unei diviziuni a micrometrului ocular, determinandu-se astfel marimea formatiunii respective.

4.2. Examenul caracterelor culturale

Dezvoltarea germenilor bacterieni pe mediile de cultura ia aspecte diferite in functie de specia in cauza, mediul folosit si, uneori, conditiile de cultivare. Pentru unele specii o serie de caractere culturale reprezinta particularitati deosebit de pretioase pentru identificarea lor.

Examenul caracterelor culturale in mediile lichide

In aprecierea dezvoltarii bacteriilor se au in vedere turbiditatea, depozitul si formatiunile de suprafata .

Turbiditatea poate fi pronuntata, discreta sau poate sa lipseasca.

Depozitul ia nastere prin depunerea la fundul tubului a germenilor care s-au dezvoltat in mediu. EI poate fi discret sau abundent, granular, vascos sau pulverulent, omogenizabil sau neomogenizabil prin agitare, aderent sau nu la fundul tubului.

Suprafata mediului poate oferi aspectul unei membrane de grosimi variabile, rugoasa, granulara, incretita sau neteda sau al unui inel de grosimi variabile la suprafata lichidului.

4.2.2. Examenul caracterelor culturale pe mediile solide

Germenii constituie, prin multiplicare, aglomerari cunoscute sub numele de colonii, vizibile cu ochiul liber sau cu lupa. In aprecierea lor, se au in vedere: dimensiunile, forma in ansamblu, profilul, suprafata, marginile, culoarea, opacitatea, consistenta, emulsionabilitatea .

Sub aspectul dimensiunilor, coloniile pot fi de talie variabila, pana la cativa milimetri diametru.

Forma poate fi circulara, ovalara, radiata sau neregulata.

Profilul (in sectiune prezumtiva) poate avea un aspect plat, convex, concav, ombilicat, mamelonat sau papiliform.

Suprafata poate fi neteda, aspra, granulara, lucioasa sau mata.

Marginile pot fi uniforme, neregulate sau cu prelungiri.

Culoarea coloniilor este diferita in functie de prezenta si natura pigmentului pe care il contin (alb, galben, verde, rosu, portocaliu etc.).

Sub raportul opacitatii, coloniile pot fi translucide sau opace, intre ele existand grade intermediare.

Consistenta este si ea variabila: onctuoasa, vascoasa, uleioasa, grunjoasa, friabila, filanta, determinand cel mai adesea si gradul de aderenta la suprafata mediului. In timp ce coloniile de consistenta onctuoasa si granulara se desprind cu usurinta, cele vascoase adera la suprafata mediului, fiind greu detasabile.

Emulsionabilitatea poate fi usoara sau dificila si face ca suspensiile care se practica in ser fiziologic sa fie stabile, omogene sau instabile, neomogene. Cateva exemple, in acest sens, pot fi edificatoare:

In medii lichide:

mediul poate fi tulbure omogen (salmonele, stafilococi);

mediul poate fi tulbure, cu un inel pe perete, la limita superioara a mediului (E. coli);

mediul poate fi clar, insa la fund prezinta un depozit grunjos sau nisipos (streptococi);

mediul poate fi clar, cu un depozit floconos si aderent la fundul tubului (bacilul antraxului);

mediul prezinta un val subtire la suprafata (vibrionul holeric);

mediul prezinta o membrana uscata la suprafata (Bacillus subtilis);

mediul prezinta o membrana groasa, rugoasa, plisata la    suprafata, restul lichidului ramanand limpede (M. tuberculosis);

mediul este colorat in verde albastrui ( bacilul piocianic).

Pe medii solide: E coli da colonii rotunde, cu margini si suprafete netede de 3 -5 mm diametru, de culoare alba laptoasa, lucioasa;
Pasteurella da, de regula, colonii mici, abia vizibile, transparente, uneori usor albastrui; aderente la mediu;
B. anthracis da colonii cu suprafata aspra si cu margini avand prelungiri laterale, efilate, care, privite cu lupa, au aspectul unor ondulatii ale firelor de par;
stafilococii dau colonii rotunde, bombate, cu margini si suprafete netede, unele dintre ele pigmentate in alb, auriu sau citrin;

streptococii dau colonii mici, bombate,
bacilul tuberculozei umane produce colonii rugoase, uscate, cu margini    neregulate.

Bacteriile anaerobe ofera si ele aspecte variabile in functie de mediul folosit la cultivarea lor.

In cazul mediilor lichide, in general se produce o tulburare uniforma, cu sau fara producere de gaze, vizibile sub forma unor bule fie in intimitatea mediului, fie la suprafata.

In cazul mediilor semisolide (geloza Veillon) se pot forma doua tipuri de colonii, in functie de difuzibilitatea germenilor in mediu, insusire legata de prezenta mobilitatii. Bacteriile mobile (CI. tetani, CI. chauvoei) produc colonii pufoase, cu aspect sferoid, in timp ce cele imobile (CI. perfringens) produc colonii de aspect lenticular, de talie variabila. Unele din ele au mameloane centrale caracteristice, altele pot determina lichefierea partiala sau totala a mediului.