Expresia MCP-1 si fractalkinei induse de diabetul experimental la soareci

Expresia MCP-1 si fractalkinei induse de diabetul experimental la soareci. Efectul aspirinei si fenofibratului (date preliminare).

a. INTRODUCERE SI OBIECTIVE

Expresia genica si proteica crescuta a MCP-1 si fractalkinei a fost observata la animalele si oamenii cu arterioscleroza sau ateroscleroza [Takeya et al., 1993; Yla-Herttuala et al., 1991; Greaves et al., 2001]. Tratamentul cu anticorp anti-MCP-1 previne infiltrarea a monocitelor in vasele coronariene si ariile interstitiale miocardice [Koyanagi et al., 2000]. Ca urmare, tratamentul cu anti-MCP-1 inhiba dezvoltarea ulterioara a ingrosarii mediei vaselor coronare, in conditiile inhibarii sintezei NO. De asemenea, fractalkina creste procesul de adeziune a monocitelor la celulele endoteliale, adeziune celula-celula si de proliferare a celulelor musculare aortice, indicand rolul acesteia in initierea si progresia bolilor vasculare [Chandrasekar et al., 2003]. Boala vasculara aterosclerotica este cauza majora a cresterii morbiditatii si mortalitatii la persoanele cu diabet de tip 2 [Garcia et al., 1974; Kannel & McGee, 1979]. Desi prevalenta aterosclerozei este crescuta in diabetul de tip 2, mecanismele responsabile raman putin intelese. Pana in prezent nu se cunosc efectele hiperglicemiei asociate diabetului, in vivo, asupra a doua din moleculele proinflamatoare cu rol central in bolile cardiovasculare, MCP-1 si fractalkina.

Un rol foarte important in inflamatia din ateroscleroza si in agravarea procesului aterosclerotic il au de asemenea metaloproteazele matriceale (MMP), in particular gelatinazele. Celulele din peretele vascular produc si secreta MMP, expresia diferitelor MMP fiind crescuta in leziunile aterosclerotice. Spectrul MMP in leziunile aterosclerotice este diversificat datorita prezentei celulelor inflamatoare (in special macrofagele), a factorilor solubili si a interactiilor celula-celula si celula - matrice. Se crede ca degradarea matricei extracelulare de catre formele active ale MMP, detectate in vasele care sufera remodelare, faciliteaza migrarea celulara si reorganizarea generala a tesutului vascular. De asemenea se crede ca MMP slabesc peretele arterial, contribuind la destabilizarea si ruptura placii aterosclerotice.

Dozele mici de aspirina sunt folosite pentru a preveni complicatiile bolilor cardiovasculare aterosclerotice. Efectul terapeutic al aspirinei este atribuit in general functiei de inhibare plachetara [ISIS-2, 1988; Chen et al., 2000]. Daca in vivo aspirina are actiuni mai profunde si mai complexe, in particular asupra vasculaturii, ramane sa fie elucidat.

In ultimii ani s-a stabilit ca ateroscleroza este o boala inflamatoare a vasculaturii [Ross, 1999]. Astfel, nivelele circulante ale markerilor inflamatori prezic riscul de evenimente cardiovasculare in ateroscleroza, iar tratamentul cu aspirina reduce aceste nivele si riscul de evenimente vasculare [Kennon et al., 2001].

Liganzii de PPARa (fenofibratul, clofibratul, liganzi sintetici, etc) moduleaza inflamatia, interferand cu procesele implicate in adeziune celulara si recrutarea leucocitelor. Acestia reduc expresia moleculelor de adeziune induse de citokine [Marx et al., 1999; Nawa et al., 2000], prin inhibarea caii de semnalizare a NF-kB.

In studiile noastre in vitro am demonstrat efectul anti-inflamator si anti-oxidant al aspirinei si activatorilor de PPARa in celulele vasculare (celule endoteliale si celule musculare netede aflate in conditii hiperglicemice). Astfel am aratat ca nivelele crescute de glucoza induc expresia chemokinelor MCP-1 si fractalkina, expresie ce este reflectata la nivel functional prin cresterea proceselor de adeziune a si chemotaxie a monocitelor datorita supra-expresiei acestor chemokine. In studiul de fata ne propunem sa urmarim daca rezultatele obtinute in vitro se regasesc in experimentele efectuate in vivo, cu ajutorul unui model animal de soarece diabetic.

Astfel incercam sa efectul aspirinei si fenofibratului asupra componentei inflamatoare vasculare a nivelelor crescute de glucoza asociate diabetului. Prezentul studiu isi propune sa raspunda la doua intrebari: prima, daca in vivo diabetul afecteaza expresia celor doua chemokine MCP-1 si fractalkinei si mecanismele de semnalizare implicate si a doua, daca aspirina si fenofibratul au efect asupra inflamatiei vasculare induse de diabet.

b. MATERIALE SI METODE

Animalele diabetice

Pentru realizarea studiului au fost utilizati 60 soareci normali, 2 luni de viata, cu greutatea cuprinsa intre 30 si 43 grame care fusesera crescuti in conditii standard. La inceputul experimentului (timpul t₀) soarecilor li s-a colectat sange (pentru a li se determina glicemia initiala, la t₀) si au fost impartiti in doua grupe: 1) 10 soareci control, normali care au primit in continuare hrana normala si 2) 50 soareci diabetici, carora li s-a administrat intraperitoneal o injectie cu streptozotocina (150mg/Kg corp), preparata proaspat in tampon citrat 50mM, pH 4,5 si in continuare au primit hrana normala careia i-a fost scoasa vitamina PP (pelagro preventiva) pentru a accelera instalarea diabetului.

Dupa o luna (timpul t₁) soarecilor li s-a recoltat sange si determinat glicemia pentru a urmari daca diabetul s-a instalat, apoi, diabeticii din lotul 2 au fost impartiti la randul lor in trei grupe: i) 25 soareci diabetici care au primit in continuare hrana normala; ii) 10 soareci diabetici care au fost tratati timp de o luna cu fenofibrat, 100mg/kg corp/zi, prin gavaj; si iii) 15 soareci diabetici tratati timp de o luna cu aspirina, 100mg/Kg corp/zi, prin gavaj.

Dupa cele patru saptamani de tratament (t₂), soareciilor li s-a recoltat sange si au fost sacrificati, prevalandu-se aortele.

Analize Biochimice

Sangele a fost colectat pe EDTA ( 2,7mmol/l ) din plexul venos al ochiului, sau din ventricolul stang al inimii in momentul sacrificarii animalelor.

Testele plasmatice de glucoza au fost realizate prin metoda enzimatica (Dialab), la inceputul experimentului (t₀₎, la o luna dupa injectarea cu streptozotocina (t₁) si la sfarsitul experimentului, dupa terminarea perioadei de tratament (t₂).

Experimentele au fost efectuate in acord cu 'Guide for the Care and Use of Laboratory Animals' publicat de US National Institutes of Health (no 85-23, revizuita in 1996).

Western blot

Aortele isolate si pastrate in azot lichid au fost maruntite cu ajutorul unui Douncer si omogenizate in tampon de liza ce contine 20 mM dithiothreitol, 6% sodium dodecil sulphate, 0.25 M Tris pH: 6.8, 10% glycerol, b mercaptoethanol, bromphenol blue. Concentratia de proteina a fost determinata prin tehnica Amido Black folosindu-se BSA ca standard. Concentratii egale de proteina din fiecare proba au fost supuse unei electroforeze SDS-PAGE (10% sau 12%) si apoi transferate pe o membrana de nitroceluloza. Dupa incubarea cu tampon de blocare procurat de la Pierce, suplimentat cu 0.05 % Tween 20 pentru a se evita legarea nespecifica, bloturile au fost incubate cu anticorpi specifici. Imunodetectia s-a realizat cu ajutorul unui kit de chemiluminiscenta ECL (Pierce, Rockford, USA) folosindu-se un al doilea anticorp marcat cu HRP.

Determinarea activitatii metaloproteazelor MMP-2 si MMP-9 in serul animalelor normale, diabetice si diabetice tratate cu aspirina sau fenofibrat

Evidentierea formelor latente (prozimogen) si active ale metaloproteazelor matriceale MMP-2 sau MMP-9 se face prin zimografie [Galis ZS, 1994]. Serurile animalelor (colectate la diferiti timpi) au fost omogenizate in tampon de liza rece (10 mmol/L tampon fosfat/150 mmol/L NaCl cu 1% Triton X-100, 0.1% SDS, 0.5% deoxicolat de sodiu si 0.2% azida de sodiu) au fost migrate in gel de poliacrilamida 10% cu 0.1 % SDS copolimerizata cu gelatina (1mg/ml). In prealabil s-a determinat concentratia de proteina serica prin metoda Bredford (Biorad). Probele au fost reluate in tampon de solubilizare nereducator si care nu contine EDTA (acesta fiind un inhibitor al MMP) si nu au fost denaturate termic inainte de aplicarea pe gel. Dupa terminarea migrarii electroforetice, s-au efectuat doua spalari timp de 30 minute cu 2,5% Triton X-100, urmate de doua spalari timp de 20 minute in apa distilata. Dupa spalari, gelul a fost incubat la 37 C timp de 18h in tampon ce contine 50 mmol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 10 mmol/L CaCl2 (pentru activarea MMP), 1 mmol/L PMSF. In final, gelul a fost colorat intr-o solutie de 0.2 % Coomassie Blue R-250 in 50 % metanol si decolorat intr-un amestec metanol:acid acetic:apa (25:10:65 %). Benzile de liza s-au evidentiat ca benzi albe pe fond albastru si au fost densitometrate cu ajutorul programului TotalLab TL100 iar rezultatele au fost prelucrate statistic.

Metoda luminescenta de testare a activitatii NADPH oxidazei

Activitatea NADPH oxidazei in omogenate aortice a fost determinata printr-o metoda chemiluminescenta descrisa anterior de Ungvari et al. (2003). Reactia se face intr-un volum total de 150ml continand tampon fosfat (50mM), EGTA (1mM), pH 7.0, 5μM lucigenin (5μM) si NADPH (100μM). Reactia a fost declansata prin adaugarea omogenatului celular (100μg proteina). Emisia a fost inregistrata din 5 in 5 secunde, timp de 2 minute la un luminometru. Activitatea NADPH oxidazei a fost exprimata ca unitati relative de lumina (RLU)/ μg proteina.

c. REZULTATE

1) Determinarea glicemiei grupurilor de animale

La sfarsitul perioadei studiu, sorecilor li s-a recoltat sangele si au fost sacrificati. Sangele recoltat a fost centrifugat si am izolat serul. Glicemia a fost determinata in serul fiecarui animal din cele patru grupe experimentale cu ajutorul unui kit (Dialab) de determinare a glicemiei. Dupa cum putem observa in figura V.1. glicemia grupului de soareci injectati cu streptozotocina (D) este de doua ori mai mare decat a grupului de soareci normali. Tratamentul soarecilor diabetici cu fenofibrat (DF) nu are efct asupra glicemiei serice. In contrast, tratamentul cu aspirina, timp de o luna, induce o reducere semnificativa a glicemiei serice soarecilor diabetici (DA).

Figura V.1. Concentratia de glucoza in serul grupelor de animale

2) Determinarea expresiei proteice a fractalkinei si MCP-1 in omogenate aortice

Aortele animalelor din cele patru grupe diferite au fost mai intai omogenizate cu ajutorul unui Douncer. Probelor omogenizate li s-a determinat concentratia proteica si apoi a urmat determinarea expresiei proteice a celor doua chemokine prin tehnica de Western Blot. Rezultatele obtinute (figura V.2, A si B) arata ca expresia MCP-1 si fractalkinei sunt crecute in grupul soarecilor diabetici (D) comparativ cu grupul normal (N). In cazul soarecilor diabetici tratati cu aspirina expresia celor doua chemokine este redusa la nivelul expresiei in grupul control. Soarecii tratati cu fenofibrat au redus de asemena expresia MCP-1 si fractalkinei, insa efectul nu a fost la fel de mare ca in cazul soarecilor tratati cu aspirina.

Figura V.2. Expresia fractalkinei si MCP-1 in omogenat de tesut izolat de la soareci apartinand diferitelor grupe experimentale

A

B

3) Determinarea stresului oxidativ indus de diabet

Asa cum am mentionat diabetul este asociat cu stres oxidativ crescut, reflectat in nivel crescut de specii reactive de oxigen care induc activari ale acelulelor vasculare. Cum sursa principala de specii reactive de oxigen in celulele vasculare este NADPH oxidaza, am urmarit activitatea NADPH oxidazei in omogenatele aortice izolate de la cele patru grupe de animale. Determinarea activitatii s-a facut printr-o metoda chemiluminescenta, iar rezultatele obtinute pe omogenate de tesut le confirma pe cele obtinute in vitro, atat pe celulele endoteliale cat si pe celulele musculare netede. Astfel, activitatea NADPH oxidazei este crescuta in tesutul animalelor diabetice (comparatic cu animalele normale), iar aspirina, si mai putin fenofibratul, reduc activitatea NADPH oxidazei.

Figura V.3. Activitatea NADPH oxidazei in omogenate aortice de la diferitele subgrupe experimentale

4) Modularea subunitatii gp91phox de catre diabet. Efectul medicamentelor.

Detectia proteica a subunitatii gp91phox a NADPH oxidazei s-a facut in omogenatele aortice din care s-a determinat si expresia fractalkinei si MCP-1. Rezultatele obtinute arata ca expresia subunitatii gp91phox este crescuta in tesuturile animalelor diabetice (D). Tratamentul soarecilor diabetici cu aspirina si fenofibrat reduce expresia acestei proteine la nivelul expresiei din tesuturile animalelor normale (N, figura V.4.).

Figura V.4. Expresia subunitatii gp91phox

5) Expresia metaloproteazelo matriceale, gelatinaze in serul animalelor din cele patru grupe experimentale

Metaloproteazele matriceale (MMP) gelatinaze, MMP2 si MMP9 apartin unei familii largi de MMP care contin Zn²⁺ si necesita Ca²⁺ pentru activitate, fiind active la pH neutru. Activitatea MMP este aceea de a degrada componete ale matricei extracelulare. Astfel ele joaca un rol critic in remodelarea tesutului in timpul proceselor de dezvoltare dar si in procese patofiziologice ca inflamatie, reparare a tesutului, invazi tumorii si metastaza. Exceptand MMP-2 care este considerata ca fiind exprimata constitutiv, MMP sunt reglate de factori de crestere, citoine, hormoni, stres oxidativ, etc. Aceasta reglare are loc la nivel transcriptional si post-transcriptional si implica inhibitori naturali tisulari ai MMP (TIMP). Este important de subliniat ca trebuie sa se faca distinctie intre reglarea expresie genice a MMP si activitatea ei enzimatica, ultima fiin cea care induce efectele biologice ale MMP. Avand in vedere acest aspect si cunoscand rolul important al acestor MMP in complicatiile cardiovasculare, am urmarit activitatea gelatinazelor MMP2 si MMP9 eliberate in serurile animalelor apartinand celor patru grupe experimentale. Rezultatele zimografiilor (figura V.5 A) arata ca in serurile animalelor din studiul nostru detectam: MMP2 in forma activa (62 kDa) si in forma de prozimogen (68 kDa), MMP9 in forma activa (82 kDa) si forma de prozimogen (92 kDa).

Figura V.5. Activitatea gelatinolitica a serurilor provenite de la soarecii din studiu

A

B

F

C

Banda de liza care apare la masa moleculara mai mare de 100 kDa se datoreaza formarii unor dimeri de metaloproteinaze. In figurile V.5. B si C observam benzile de liza obtinute din seruri de la animale diferite. Astfel, in probele obtinute de la animalele diabetice prezinta o crestere a formei active a MMP-2 comparativ cu probele de la animalele normale. Tratrea soarecilor diabetici cu aspirina sau fenofibrat duce la scaderea cantitatii de forma activa a MMP-2. Dupa cum putem observa, si in cazul MMP efectul aspirinei este mai pronuntat decat cel al fenofibratului. De asemenea, expresia formei active a MMP-9 (figura V.5. C) este crescuta in serurile animalelor diabetice. Forma activa a MMP-9 este crescuta direct proportional cu timpul de cand s-a instalat diabetul. Astfel, la o luna de diabet (t1), MMP-9 este putin crescuta, iar la doua luni de diabet (t2) expresia formei active a MMP-9 este crescuta si mai mult.

6) Expresia formei fosforilate a MAPK_s (p38 MAPK si ERK1/2) in omogenatele aortice

In dorinta de a determina caile de semnalizare implicate in expresia crescuta a chemokinelor MCP-1 si fractalkina si a MMP-2 si -9 la soarecii diabetici, am urmarit expresia MAPK_s ERK1/2 si p38MAPK in omogenatele aortice de la animale provenind din fiecare grupa experimentala. Rezultatele preliminare arata ca expresia fosfo ERK1/2 este crescuta la animalele diabetice (D) comparativ cu cele normale (N, figura V.6. A), continuand sa ramana crescuta si la animalele diabetice tratate cu aspirina (DA) sau cu fenofibrat (DF). Acest rezultat sugereaza ca fosforilarea ERK1/2 ar putea fi implicata in expresia crescuta a chemokinelor in diabet, dar cele doua medicamente reduc expresia MCP-1 si fractalkinei, actionand pe alta cale de semnalizare.

Figura V.6 Determinarea expresiei pERK1/2 si pp38MAPK in omogenate aortice

A

B

In cazul MAP kinazei p38, rezultatele obtinute pana in prezent nu ne permit sa tragem o concluzie. Putem observa (figura V.6. B) ca la doua din animalele normale expresia este diferita, iar in cazul celor diabetice se observa o crestere. In cazul animalelor tratate exista o scadere aparenta a expresiei p38 MAPK, insa aceasta nu este semnificativa.

d. DISCUTII SI CONCLUZII

Ateroscleroza este o boala complexa si multifactoriala, iar inflamatia este implicata in patogeneza si evolutia acesteia. Nivelele crescute ale unor citokne au fost gasite in ateroscleroza umana si murina [Reape & Groot, 1999], dovezile care arata implicarea acestora in ateroscleroza fiind clare [Gu et al 1998]. De asemenea, exista studii care au evidentiat prezenta anumitor seturi de citokine sau chemokine care cresc riscul diabetului de tip 2 [Spranger et al., 2003]. In particular, o crestere combinata a IL-1b si IL-6, decat cresterea numai a IL-6, creste riscul de diabet 2. Insa, sunt mai putine studii care au urmarit efectul nivelelor crescute de glucoza asupra expresiei plasmatice si vasculare a citokinelor. Datele preliminare obtinute in studiul nostru arata ca nivelele crescute de glucoza afecteaza tesutul vascular, acesta producand expresie crescuta de MCP-1 si fractalkina, care au un rol central in procesul inflamator, favorizand atragerea celulelor inflamatoare in tesutul vascular. De asemenea, cantitatea de MMP in forma activa, eliberate in circulatie la animalele diabetice este crescuta comparativ cu animalele normale. Aceste rezultate sunt foarte importante daca ne gandim ca activitatea MMP este de a degrada matricea extracelulara si de a produce destabilizarea placii aterosclerotice, fiind unul din mecanismele care pot accelera procesul aterosclerotic in diabet. Dupa cum stim cresterea placii aterosclerotice are loc prin modificari structurale care duc la acumulare de celule, matrice extracelulara si lipide in intima arterelor bolnave. Desi mecanismele exacte care duc la cresterea numarului de celule musculare netede intimale in leziunile aterosclerotice ramane in mare masura necunoscute, contributia migrarii timpurii si proliferarii CMN a fost dovedita [Schwartz, 1997]. Recent, s-a aratat ca un rol important in migrarea CMN din medie in intima il are fractalkina, al carui receptor este exprimat din abundenta pe CMN [Chandrasekaret al., 2003]. In acest context, expresia crescuta a fractalkinei in aortele soarecilor diabetici, in plus la cresterea adeziunii si transmigrarii monocitelor in tesut, poate avea rol in procesul de migrare a CMN in intima, complicatiile vasculare asociate diabetului.

Aspirina este larg folosita in preventia secundara a complicatiilor bolilor cardiovasculare iar in studiile umane in care s-au folosit fibrati rezultatele au aratat ca in general acestia reduc progresia ateroclerozei. Cum diabetul este factor major de risc pentru bolile cardiovasculare am incercat sa urmarim efectele aspirinei si fenofibratului asupra unor molecule importante in bolile vasculare. Astfel, rezultatele obtinute pana in prezent arata ca soarecii diabetici trati cu aspirina sau fenofibrat prezinta nivele mai mici atat ale expresiei chemokinelor MCP-1 si fractalkinei cat si ale formelor active serice ale MMP-2 si MMP-9. Atat in cazul chemokinelor urmarite cat si a MMP, efectul aspirinei este mai pronuntat decat al fenofibratului. Explicatiile acestei diferente pot fi datorate cai de semnalizare prin care actioneaza aceste medicamente, iar deocamdata nu avem studii concludente in acest sens. Studiile urmatoare vor testa si alte cai de semnalizare si vor stabili prin ce mecanisme actioneaza fiecare din aceste doua medicamente. De asemena, o observatie importanta ce poate explica diferenta dintre eficienta diferita a medicamentelor este ca aspirina (si nu fenofibratul) reduce concentratia de glucoza in sangele animalelor diabetice. Nivelul scazut al hiperglicemiei poate fi asociat cu nivelul scazut al stresului oxidativ, si astfel scadere a activarii celulelor peretelui vascular. De altfel, rezultatele testarii activitatii NADPH oxidazei sustin aceasta presupunere, activitatea acestei enzime fiind redusa la nivelul activitatii animalelor normale in grupa animalelor diabetice tratate cu aspirina, insa o reducere mult mai slaba in cazul animalelor tratate cu fenofibrat.

Foarte important este ca rezultatele obtinute in vivo le sustin pe cele in vitro obtinute pe celulele endoteliale si musculare netede umane.

Impreuna, datele obtinute pana in prezent sugereaza ca aspirina si fenofibratul manifesta efecte anti-inflamatoare in conditii de diabet, in vivo, reducand inflamatia vasculara (prin reducerea expresiei MCP-1 si fractalkinei) si crescand stabilitatea vasculara (prin scaderea nivelului formelor active ale MMP-2 si MMP-9).