LIMFOCITELE

Limfocitele sunt principalele celule implicate in raspunsul imun. Din punct de vedere histologic ele fac parte din tesutul limfoid.

Tesutul limfoid cuprinde organele limfoide centrale si periferice. Organele limfoide centrale sunt maduva hematogena si timusul. Maduva hematogena este sursa tuturor limfocitelor care populeaza tesuturile limfoide. Organele limfoide periferice sunt :

Splina

Ganglionii limfatici

Tesutul limfoid asociat mucoaselor - MALT (mucous associated lymphoid tissue)

Tesutul limfoid de la nivel cutanat - SALT (skin associated lymphoid tissue).

Populatiile limfocitare

Limfocitele reprezinta 20-40% din totalul leucocitelor, sau in cifre absolute intre 1500-3000/mmc, in medie 2500/mmc. Limfocitele apar la microscopul optic, pe frotiul colorat policromatic (Giemsa sau Wright), cu doua morfologii : limfocite mici si mari.

Limfocitele tipice sunt cele mici. Aceasta categorie cuprinde limfocitele T (LT) si limfocitele B (LB). Limfocitele mici reprezinta peste 95% din totalul limfocitelor si au urmatoarele caractere :

Au diametrul de 6-10 microni.

Au un nucleu ovoid sau reniform, care ocupa cam 90% din suprafata celulei si prezinta cromatina nucleara densa.

Perinuclear apare un inel de citoplasma colorat albastru deschis.

Citoplasma contine organite celulare si 5-15 granulatii azurofile.

In citoplasma se detecteaza o serie de enzime : fosforilaze, hidrolaze acide, enzime mitocondriale. Citoplasma nu contine peroxidaze, enzime caracteristice pentru monocite si granulocite.

Limfocitele mari, numite si "large granular lymphocytes" sau LGL, reprezinta cam 3% din totalul limfocitelor. Din aceasta clasa cele mai importante sunt celulele NK (natural killer), cu rol in imunitatea denumita innascuta sau nespecifica, indreptata contra celulelor infectate viral si tumorale, in cadrul RIC. Alaturi de NK, grupul LGL cuprinde celulele K, NK-like si LAK (lymphokine-activated killer). Limfocitele mari au urmatoarele caractere comune :

Au diametrul de 10-15 microni.

Au mai multa citoplasma, care contine granulatii dense.

Limfocitele mici se impart functional in LB si LT. Aceste doua tipuri de limfocite nu se pot diferentia morfologic, prin microscopie optica, ci functional, prin testele de rozetare :

Daca se pun in contact limfocitele cu hematii de oaie sau berbec, numai LT se leaga de aceste hematii, adica rozeteaza. La microscop se vizualizeaza mici conglomerate celulare formate dintr-un LT central inconjurat de o coroana de hematii de oaie, care se numesc rozete E.

Daca se pun in contact limfocitele cu hematii de soarece, numai LB se leaga de aceste hematii, producandu-se rozete M.

LIMFOCITELE T

Limfocitele T (LT) reprezinta functional o populatie celulara heterogena. Clasele de LT seamana morfologic si toate rozeteaza cu hematiile de oaie. Ele se diferentiaza numai prin receptorii sau markerii de suprafata, care se evidentiaza cu anticorpi monoclonali. Receptorii sau markerii de suprafata sunt notati cu CD (clasa de diferentiere sau cluster of differentiation). In functie de prezenta lor selectiva pe diferitele subgrupuri limfocitare, markerii sunt de mai multe categorii :

Markerii panantigenici - sunt comuni pentru toate subtipurile limfocitare din grupele B si T, indiferent de etapa de maturare.

Markerii de maturare - se sintetizeaza si sunt represati succesiv, in timpul ontogeniei limfocitare, adica pe parcursul maturarii de la precursorii medulari spre formele adulte.

Markerii de activare - se exprima numai pe limfocitele activate in cursul raspunsului imun.

In functie de markerii de suprafata, LT se impart in patru subclase :

LTH - helper

LTS - supresor

LTCS - contrasupresor

LTC - citotoxic

Toate subclasele de LT poseda o serie de caractere comune :

LT reprezinta populatia majoritara dintre limfocitele mici din periferie, respectiv intre 55-75% din limfocitele mici sanguine, 100% din populatia limfocitara a timusului si circa 25% din limfocitele din maduva hematogena.

LT au viata lunga, de ani sau zeci de ani.

LT sunt celule intens recirculante, adica se deplaseaza continuu intre organele limfoide secundare si tesuturi, in cautarea antigenelor pentru care sunt programate.

LT rozeteaza cu hematiile de oaie.

Receptorii de suprafata ai LT mature

LT care parasesc timusul se numesc  de repaus ,  naive  sau  virgine , pentru ca ele nu au venit inca in contact cu antigenul corespunzator. Receptorii lor de suprafata sunt de trei categorii (tabelul 3) :

Receptorii de recunoastere a epitopului reprezinta principala cale de activare a LT. Acest grup cuprinde complexul TCR-CD3 si coreceptorii CD4 si CD8. Complexul TCR-CD3 recunoaste epitopul si este prezent pe toate subtipurile de LT. CD4 si CD8 sunt coreceptori care recunosc moleculele MHC asezate pe APC sau pe celulele somatice. Moleculele MHC prezinta epitopul. CD4 recunoaste MHC II, iar CD8 recunoaste MHC I. Pentru ca simultan sunt recunoscute antigenele si moleculele MHC, spunem ca recunoasterea antigenica realizata de LT este asociativa.

Receptorii cu rol accesor in activarea LT sunt CD28 si CD45.

Receptorii cu rol in adeziunea intercelulara permit LT sa adere intim de alte celule : APC, celule somatice, celule tinta. Receptorii de adeziune ai LT sunt CD2 si LFA1.

I. Receptorii cu rol in recunoasterea epitopului

Recunoasterea epitopului de catre LT are cateva caracteristici generale :

LT recunosc un epitop ca non-self dupa structura liniara sau primara.

LT recunosc epitopii numai daca acestia sunt prezentati in complex cu moleculele prezentatoare MHC, de pe membranele APC sau a celulelor somatice. Spre deosebire de receptorii BCR cu structura de imunoglobuline de pe suprafata LB, receptorii TCR-CD3 nu pot recunoaste antigenele native, ci numai fragmentele peptidice prelucrate de celulele APC.

Recunoasterea epitopului este obligatoriu asociativa, adica LT recunosc simultan epitopul si molecula MHC. Prezentarea epitopului se poate produce numai intre celule care apartin aceluiasi organism, in conditii de restrictie de histocompatibilitate.

Moleculele MHC sunt expuse numai pe membranele celulare. Din acest motiv LT pot sa recunoasca numai antigenele membranare. Antigenele prezentate pe membrane pot fi :

Antigene expuse pe moleculele MHC.

Antigene constitutive, adica structuri proteice ale membranei.

Antigene atasate accidental de membrana, de exemplu haptene.

LT recunosc numai antigenele expuse in complex cu moleculele MHC self. LT realizeaza o recunoastere antigenica MHC-dependenta.

TCR

Molecula TCR (T-cell receptor) este formata din doua lanturi :

Receptorul TCR este format din lanturile a si b, fiind prezent la 95% dintre LT.

Receptorul TCR1 este format din lanturile g si d, fiind prezent la 5% dintre LT, mai ales pe LT din tegumente si mucoase.

Lanturile care compun TCR au structura Ig-like :

Lanturile a si g seamana cu lanturile L ale imunoglobulinelor.

Lanturile b si d seamana cu lanturile H ale imunoglobulinelor.

Fiecare lant are un segment intracitoplasmatic foarte scurt, un segment transmembranar, un segment de legatura si cate doua domenii extracelulare, de cate 100 de aminoacizi, asezate fata in fata :

Domeniile dinspre exterior sunt variabile si se noteaza cu V.

Domeniile dinspre membrana sunt constante si se noteaza cu C.

Regiunea dintre buclele constante C si insertia pe membrana limfocitara a lanturilor TCR se numeste zona balama a TCR. Ea da mobilitatea TCR, foarte importanta pentru recunoasterea antigenelor. Moleculele TCR sunt mobile in toate planurile, facand miscari de baleiere. In zona balama lanturile a si b, respectiv g si d, se asociaza prin punti disulfurice.

Cele doua domenii variabile se asociaza si formeaza o cavitate numita situsul de recunoastere pentru antigen, sau paratop, asemanator cu paratopul imunoglobulinelor. Genele care codifica domeniile variabile ale TCR seamana structural cu genele domeniilor variabile ale imunoglobulinelor, iar variabililitatea este de asemenea obtinuta prin procese de recombinare genica. Situsurile de recunoastere nu se leaga de molecula de antigen pe toata lungimea. De fapt contactele sunt punctiforme, prin 6 secvente scurte de aminoacizi care proemina in interiorul situsului combinativ, cate trei secvente pe fiecare domeniu V. Aceste secvente scurte se numesc CDR (complementarity determining regions) si sunt hipervariabile.

CDR1 si CDR2 se leaga cu domeniile polimorfe ale MHC (a a2 ale MHC I si a b1 in cazul MHC II).

CDR3 se leaga de epitop, avand structuri complementare.

Functiile receptorilor TCR sunt :

TCR recunosc antigenul.

TCR declanseaza stimulii activatori pentru LT. Dupa ce buclele V a si V b recunosc complexul MHC-epitop, apar in TCR modificari conformationale si se produc stimuli activatori care sunt transmisi in citoplasma LT.

TCR nu poate sa transmita singur semnalul activator pentru ca TCR are un segment intracitoplasmatic foarte scurt, iar enzimele care activeaza LT sunt asezate profund in citoplasma LT. De aceea transductia semnalului se face prin intermediul receptorului CD3.

CD3

CD3 este un receptor membranar cu structura complexa, asezat langa receptorul TCR. CD3 face transductia semnalului activator primit de TCR spre interiorul LT.

CD3 este format din cinci lanturi scurte : gama (g), delta (d), epsilon (e), eta (h), zeta (z). Domeniul intracitoplasmatic al lantului zeta are functie de PTK (proteinkinaza). Aceasta enzima fosforileaza in prezenta ATP unele proteine si le modifica activitatea.

Toate cele 7 lanturi din complexul TCR-CD3 (doua ale TCR si cinci ale CD3) se asociaza prin punti disulfurice sau prin legaturi necovalente. Ele formeaza un complex unitar care transmite stimulul activator in interiorul LT.

CD4

CD4 este un coreceptor care participa la recunoasterea antigenica asociativa.

CD4 este receptorul de suprafata sau markerul caracteristic pentru LTH.

CD4 are un segment intracitoplasmatic, un segment transmembranar si un segment extracelular. Segmentul extracelular al CD4 are trei domenii sau bucle de marime diferita. Prin bucla exterioara N-terminala, CD4 se leaga de domeniul monomorf al MHC II, care este domeniul a

Segmentul intracitoplasmatic al CD4 este foarte lung. El participa la activarea metabolica a LTH, prin activarea unor enzime intracelulare.

CD4 este si receptorul de care se ataseaza virusul HIV.

CD8

CD8 este un coreceptor care participa la recunoasterea antigenica asociativa. El se gaseste mai ales pe LTC, dar si pe LTS si LTCS. CD8 este marker definitoriu pentru LTC.

CD8 are doua lanturi, a si b Fiecare dintre lanturi are un segment intracitoplasmatic, un segment transmembranar si un segment extracelular. Cele doua segmente extracelulare au cate un domeniu. Cele doua domenii se asociaza si au un aspect Ig-like. Ele participa la cooperarea dintre LTC sau LTS si APC. In timpul cooperarii, segmentul extracelular al CD8 se leaga de domeniul monomorf al MHC I, care este a

Segmentul intracitoplasmatic al CD8 este foarte lung. El participa la activarea metabolica a LTC si LTS, prin activarea unor enzime intracelulare.

II. Receptorii cu rol accesor

CD28

CD28 se gaseste pe LTH si pe LTC, care impreuna reprezinta cam 80% din LT circulante. CD28 nu se gaseste pe LTS.

CD28 are o structura de tip Ig-like, cu un segment intracitoplasmatic lung, un segment transmembranar si un segment extracelular care are un domeniu.

Prin domeniul extracelular, CD28 se leaga cu un contrareceptor de pe APC, notat CD80.

Prin segmentul intracelular lung, CD28 activeaza mesagerii secunzi proteici din LTH sau LTC care induc productia de citokine.

CD45

CD45 se gaseste pe toate clasele de LT si de aceea se mai numeste LCA (antigenul comun leucocitar). El este legat prin punti disulfurice de lanturile zeta ale CD3.

CD45 activat devine o enzima transmembranara numita PTP (protein-tirozin-fosfataza). PTP impreuna cu PTK sunt principalele enzime implicate in activarea LT. Ele formeaza un cuplu functional care controleaza durata si intensitatea activarii limfocitare prin stabilirea echilibrului dintre fosforilarile si defosforilarile celulare.

III. Receptorii de adeziune intercelulara

Acesti receptori permit stabilirea de contacte intre LT si APC sau celulele somatice si permit cooperarea dintre ele. Principalii receptori implicati in aderarea LT sunt : LFA1, CD2, VLA.

LFA1

LFA1 sau antigenul asociat functiei limfocitare face parte din familia integrinelor. Integrinele sunt receptori celulari care permit aderarea de endoteliu, de proteinele matricei extracelulare si de alte celule (APC, celulele tinta).

LFA1 este prezent pe membrana LT, LB, MO, MF, PMN. El este un heterodimer format dintr-un lant a (CD11a) cu greutate moleculara de 180 kDa si un lant b (CD18) cu greutate moleculara de 95 kDa. LFA1 se leaga de ICAM (intercellular adhesion mollecule) prin segmentul extracelular, care are doua bucle cu structura Ig-like.

Exista doua tipuri de ICAM :

ICAM 1 se afla pe suprafata tuturor celulelor din organism.

ICAM 2 se afla in special pe celulele endoteliale.

Aderarea intercelulara mediata de LFA1 este inductibila, adica ea este stimulata de recunoasterea antigenului si legarea lui la complexul TCR-CD3. Recunoasterea antigenului declanseaza in LT cascada fosfatidil-inozitol, care in final duce la eliberarea ionilor de calciu din reticulul endoplasmic si la activarea proteinkinazei C (PKC), care prin fosforilare activeaza receptorul LFA1. Daca stimularea antigenica nu se produce, activitatea PKC este inhibata, receptorul LFA1 devine inactiv si LT se desprinde de celula cu care era in contact. Acest fenomen permite ca LT sa vina in contact succesiv cu o multitudine de celule somatice sau APC, in cautarea antigenului.

LFA1 are rol si in extravazarea si migrarea intratisulara a LT. LFA1 adera de liganzii ICAM1, a caror expresie este mult crescuta pe celulele endoteliale din focarele inflamatorii.

VLA

Receptorii VLA fac parte din familia integrinelor. Moleculele VLA1 si 2 sunt caracteristice pentru LT. VLA sunt molecule de adeziune la endoteliu (VLA4) si la proteinele din matricea extracelulara. Ele dau LT posibilitatea sa se deplaseze prin tesuturi si sa se concentreze intratisular in zona unde se gasesc antigenele.

CD2

Receptorul CD2 se mai numeste LFA2. CD2 face parte din superfamilia imunoglobulinelor si se gaseste pe membrana tuturor LT si pe NK. CD2 are un segment intracitoplasmatic, un segment transmembranar si un segment extracelular. CD2 este si receptorul LT pentru hematiile de oaie.

Prin segmentul extracelular, CD2 se leaga de receptorul LFA3 de pe APC sau de pe celulele somatice.

Prin segmentul intracitoplasmatic, CD2 stimuleaza PLC (fosfolipaza C). Dupa stimulare, PLC declanseaza cascada fosfatidil-inozitol.

Moleculele de aderare au o serie de functii esentiale pentru raspunsul imun :

Prin aceste molecule LT stabilesc permanent contacte cu APC sau cu celulele somatice pe care le controleaza daca prezinta sau nu antigene. Contactele sunt antigen-independente, adica se fac indiferent daca APC sau celula somatica prezinta sau nu antigene pe suprafata. Cuplurile de adeziune LFA1-ICAM1 si CD2-LFA3 au rol in aceasta etapa initiala a recunoasterii antigenice. 

Receptorii de adeziune nu participa direct la recunoasterea epitopilor, dar au un rol esential in recunoastere pentru ca realizeaza un contact intim intre LT si APC. Contactul se face pe suprafete mari de membrana si dureaza mult, favorizand contactul moleculelor MHC si TCR, care sunt asezate in locuri diferite pe membrane si pentru a se intalni fac miscari de difuzie laterala.

Cuplurile de adeziune se desfac dupa recunoasterea antigenelor, sau daca celula APC sau somatica nu prezinta antigene. In acest fel LT isi continua circuitul prin organism, adica se face recircularea LT.

Receptorul CD2 are rol si in activarea metabolica a LT. Rolul activator al CD2 este indispensabil mai ales cand concentratia de epitopi prezentati spre TCR este scazuta, astfel ca numai recunoasterea epitopilor de catre TCR-CD3 nu este suficienta pentru activarea LT.

LIMFOCITELE B

LB reprezinta 15-30% din totalul limfocitelor mici circulante. Ele au o serie de caractere generale :

LB au durata de viata scurta, de cateva saptamani.

LB sunt celule putin recirculante, ele sunt cantonate in ariile burso-dependente din organele limfoide secundare - ganglionii limfatici si splina.

Denumirea de limfocite B vine de la  bursa lui Fabricius , care este un organ limfoid la pasari, in care se matureaza LB formate in maduva hematogena. La mamifere s-a stabilit ca nu exista un echivalent al bursei lui Fabricius, ci LB se matureaza tot in maduva hematogena.

Receptorii de suprafata ai LB sunt de trei categorii :

Receptorii cu rol in recunoasterea antigenelor si in activarea LB : BCR

Receptorii de adeziune intercelulara : LFA1

Receptorii cu rol accesor in activare : CD45, CD25

Recunoasterea antigenelor de catre LB are unele caractere :

LB recunosc epitopii dupa structura lor conformationala, spatiala sau tridimensionala.

LB recunosc antigene solubile native, adica neprelucrate de APC, spre deosebire de LT. Pentru LB nu este necesara prezentarea antigenelor pe moleculele MHC.

BCR

Receptorul principal de recunoastere a antigenelor este BCR (B-cell receptor). BCR este o molecula de imunoglobulina monomerica transmembranara, cel mai frecvent monomer de IgM sau IgD.

BCR are urmatoarea structura :

Doua lanturi grele H, transmembranare, care au un segment extracelular, un segment transmembranar hidrofob si un scurt segment intracitoplasmatic.

Doua lanturi usoare L, strict extracelulare.

Spre exterior, la capatul N-terminal, lanturile H si L au bucle variabile V care se asociaza si formeaza doua situsuri combinative identice pentru determinantul antigenic expus la suprafata antigenului nativ.

Dupa recunoasterea antigenului, BCR participa la activarea LB. Lanturile H ale BCR sunt asociate cu doi receptori numiti Ig a si Ig b, care au acelasi rol ca CD3 la LT, adica fac transductia semnalului activator spre interiorul LB.

Semnalul se transmite de la BCR la Ig a si Ig b si mai departe la CD45 care se activeaza si devine PTP. In continuare CD45 declanseaza cascada fosfatidil-inozitolilor care activeaza o serie de factori nucleari care induc in final

proliferarea LB din clona activata si transformarea lor in plasmocite, adica celule producatoare de imunoglobuline.

PLASMOCITELE

Plasmocitele apar prin activarea LB si diferentierea lor terminala in urma stimularii antigenice si de catre LTH. Procesul de diferentiere implica modificari morfologice si imunofenotipice. LB trec prin stadiile succesive de : imunoblast B, plasmoblast, pre-plasmocit si plasmocit. Pe parcurs celulele pierd antigenele LB de repaus si de activare. Apar noi markeri de suprafata, de exemplu CD38 si CD71 cu rol in proliferare.

Diferentele morfologice si structurale ale plasmocitelor fata de LB exprima functia lor de sinteza si de secretie a imunoglobulinelor, care asigura RIU. Caracterele morfologice ale plasmocitelor sunt :

Plasmocitele sunt ovale si au diametrul de 7-25 microni.

Nucleul este sferoidal, cu zone dense de heterocromatina orientata in  spite de roata .

Citoplasma este abundenta si intens bazofila, datorita continutului mare de ARN. Caracteristic citoplasma contine reticul endoplasmic rugos abundent, cu multi ribosomi implicati in sinteza imunoglobulinelor.