STRUCTURA SI ORGANIZAREA MATERIALULUI GENETIC

Acizii nucleici (acidul dezoxiribonucleic - ADN si acidul ribonucleic - ARN) sunt macromolecule informationale prezente in celule. Informatia genetica, stocata in moleculele de ADN, este transcrisa in molecule de ARN si apoi tradusa in proteine (polipeptide).

1. STRUCTURA ADN

1.1. Structura primara a ADN.

ADN este un polimer de dezoxiribonucleotide. Unitatea structurala a ADN este dezoxiribonucleotidul, avand in componenta trei elemente distincte: o pentoza, o baza azotata si grupul fosfat (figura 1.1).

a) Pentoza este un glucid cu 5 atomi de carbon, reprezentat de dezoxiriboza, care prezinta o grupare OH in pozitia 3'.

b) Baza azotata poate fi purinica - adenina (A) si guanina (G) - sau pirimidinica - citozina (C) si timina (T). Baza azotata se leaga printr-o legatura N-glicozidica de carbonul 1' al dezoxiribozei, formind un nucleozid.

c) Grupul fosfat (P) se ataseaza la carbonul 5' al pentozei, formand un nucleotid. Radicalul de acid fosforic confera moleculei un caracter acid.

Nucleotidele din ADN se leaga intre ele prin legaturi covalente 3'-5' fosfodiester, stabilite intre OH 5' al dezoxiribozei unui nucleotid si OH 3' al dezoxiribozei nucleotidului urmator. Se constituie, astfel, un lant polinucleotidic continuu, liniar, lung, care reprezinta structura primara a ADN.

In structura polinucleotidului (catenei), complexul fosfat-dezoxiriboza este constant, iar baza azotata este variabila.

In catena de ADN, nu exista o restrictie cu privire la asezarea nucleotidelor, acestea putand ocupa orice pozitie a catenei. Succesiunea nucleotidelor in lungul moleculei de ADN reprezinta informatia genetica codificata, pe baza careia este stabilita ordinea aminoacizilor in proteine. Aceasta informatie este citita in sensul 5' - 3'.

1.2. Structura secundara a ADN

Molecula de ADN este constituita din doua catene polinucleotidice care formeaza un dublu helix (figura 1.2). Catenele sunt conectate intre ele prin intermediul legaturilor de hidrogen: doua intre A si T si trei intre G si C. Formarea legaturilor de hidrogen este posibila numai intre o baza purinica de pe o catena si o baza pirimidinica de pe catena opusa. Astfel, cele doua catene ale ADN nu sunt identice, ci complementare. Legea complementaritatii bazelor azotate sta la baza realizarii functiilor genetice ale ADN: replicarea, transcrierea, etc.

Cele doua catene din structura dublului helix au o orientare antiparalela (in sensurile 5' - 3', respectiv 3' - 5'), ca urmare a legaturilor dintre bazele complementare. Catenele, asemanatoare cu doua panglici, sunt rasucite una in jurul alteia, si ambele in jurul unui ax imaginar, de la stanga la dreapta (dextrogir). Se formeaza, astfel, un dublu helix, asemanator unei scari in spirala, in care axele glucidofosforice reprezinta marginile, iar perechile de baze treptele scarii.

Bazele azotate sunt dispuse in interiorul helixului, perpendicular pe axul glucido-fosforic. Fiecarui tur complet al spirei ii corespund 10 pb.

Diametrul dublului helix este de 2 nm. La exteriorul helixului sunt vizibile doua santuri: un sant mare, important pentru fixarea pe molecula de ADN a proteinelor reglatoare, si un sant mic, necesar fixarii histonelor.

Modelul descris corespunde formei B a ADN care, in conditii fiziologice, este forma predominanta. Modelul dublu catenar al ADN asigura stabilitatea informatiei genetice.

2. STRUCTURA GENOMULUI UMAN

Termenul genom desemneaza ansamblul secventelor de ADN a unui individ sau specii.

Cantitatea totala de ADN din celulele umane diploide este de 7 pg (picograme), iar marimea totala a genomului uman este de circa 3,3 Gb (3,3 x 10⁹ pb) (pb = perechi de baze). Puse cap la cap, cele 23 de molecule ADN din genomul haploid depasesc 1 m, iar lungimea tuturor moleculelor ADN din organismul uman este de 2,5.10 km

Numarul presupus de gene este intre 20.000 si 25.000, iar secventele codante reprezinta sub 10% din genom. Genele sunt dispersate pe cromozomi si separate prin regiuni intergenice, necodante, de dimensiuni mari. Rolul regiunilor necodante inca nu este cunoscut.

Genomul uman este alcatuit dintr-un genom nuclear si un genom mitocondrial.

2.1. Genomul nuclear

2.1.1. Organizarea genomului uman nuclear

Genomul nuclear cuprinde 20.000-25.000 de gene si are o lungime de 3,2 Gb. Contine peste 99% din ADN celular (figura 1.3).

2.1.2. Tipuri de ADN nuclear

Sunt descrise mai multe clase de ADN, diferite prin repetitia secventelor nucleotidice:

► ADN nerepetitiv reprezinta circa 60% din lungimea totala a genomului uman si este alcatuit din secvente unice per genom. Este dispus printre secventele repetitive, in regiunile eucromatice.

Circa 2% din secventele nerepetitive reprezinta regiunile codante ale genelor care codifica proteine (exonii); restul ADN-ului nerepetitiv este necodant, prezent in interiorul genelor (introni) si in regiunile dintre gene, iar functia sa este inca necunoscuta.

► ADN moderat repetitiv reprezinta circa 30% din genomul uman si este alcatuit din secvente scurte (300-1000 pb), repetate de zeci si sute de mii de ori si dispersate in genom. Se gaseste in principal in structura genelor care codifica ARN ribozomal si ARN de transfer.

► ADN inalt repetitiv reprezinta 10% din genom si este alcatuit din secvente foarte scurte (2-200 pb), repetate de in tandem de milioane de ori. Secventele inalt repetitive, care nu sunt transcrise, sunt reprezentate de sateliti, minisateliti si microsateliti.

- satelitii sunt prezenti in heterocromatina constitutiva din anumite regiuni cromozomiale - centromer, telomere, constrictii secundare, benzi G, precum si din cromozomul Y (corpusculul fluorescent); ADN satelit are deci rol structural.

- minisatelitii reprezinta markeri genetici ai individului: amprenta ADN (DNA fingerprinting) sau profilul ADN: numarul de copii ale secventei unui minisatelit, precum si variantele secventelor acestuia variaza de la o persoana la alta, astfel incat probabilitatea de a intalni doi indivizi neinruditi identici este mai mica de 10

- microsatelitii sunt cel mai frecvent dinucleotidice, distribuite neuniform la nivelul genomului.

Mini- si microsatelitii sunt localizati in ADN extragenic si introni.

2.2. Genomul mitocondrial

Genomul mitocondrial are o lungime de 16,6 Kb. Contine un singur tip de ADN circular, dublu catenar.

In fiecare celula umana exista cateva mii de copii ale ADN mitocondrial (ADNmt). Genomul mitocondrial al zigotului provine exclusiv de la ovul, deci este mostenit numai de la mama.

3. ORGANIZAREA ADN IN CELULA

Structura nucleului difera in interfaza si diviziune.

Nucleul interfazic este compus din: membrana nucleara dubla, matrice nucleara, cromatina, nucleoplasma si nucleol (cu rol in formarea ribozomilor).

In nucleu, fiecare molecula de ADN se asociaza cu proteine bazice (histone), proteine nehistonice si cantitati mici de ARN, formand cromatina. Moleculele de ADN si histone sunt spiralizate succesiv, realizand un sistem de fibre de cromatina, de dimensiuni diferite. In urma acestor spiralizari moleculele lungi de ADN devin mai compacte, adaptandu-se astfel la dimensiunile de cativa microni ale nucleului.

La inceputul diviziunii, fibrele de cromatina se spiralizeaza, se condenseaza si formeaza cromozomii; la sfarsitul diviziunii, cromozomii se despiralizeaza, pentru ca in interfaza sa se prezinte din nou sub forma fibrelor de cromatina. Astfel, cromatina si cromozomii reprezinta doua modalitati diferite de organizare morfologica si functionala a materialului genetic.

3.1. Cromatina

3.1.1. Eucromatina si heterocromatina

Cromatina reprezinta complexul format din ADN nuclear si proteine. Ea se prezinta microscopic sub doua aspecte, diferite ca structura si functie: eucromatina si heterocromatina.

► Eucromatina este mai putin condensata si slab colorata cu coloranti bazici; reprezinta cromatina activa genetic (transcriptionala); contine predominant ADN nerepetitiv.

► Heterocromatina este puternic condensata sub forma de cromocentri si colorata mai intens cu coloranti bazici; este cromatina inactiva genetic; contine mai mult ADN repetitiv. Heterocromatina este de doua tipuri: constitutiva si facultativa.

- Heterocromatina constitutiva ramane sub forma condensata pe tot parcursul ciclului celular. Nu contine gene functionale si este formata din ADN inalt repetitiv. La nivel cromozomial, heterocromatina constitutiva se gaseste in la nivelul centromerului, a telomerelor, la nivelul constrictiilor secundare, pe bratul lung al cromozomului Y si pe bratele scurte ale cromozomilor acrocentrici.

- Heterocromatina facultativa este o forma de cromatina care a fost sau va fi activa intr-un stadiu al dezvoltarii ontogenetice si care intervine probabil in reglarea genelor; contine secvente de ADN nerepetitiv. Exemplul cel mai caracteristic il constituie cromatina sexuala X, unul dintre cei doi cromozomi X inactivati in celulele somatice feminine.

3.1.2. Cromatina sexuala

Cromatina sexuala reprezinta un cromocentru distinct, care permite stabilirea sexului genetic (XX sau XY) si a anomaliilor numerice ale cromozomilor sexuali.

Cromatina sexuala difera la sexul feminin si masculin, deoarece rezulta prin mecanisme diferite.

Cromatina X

La femei (XX), cromatina sexuala rezulta in urma inactivarii unuia din cei doi cromozomi X. Cromozomul X condensat (heterocromatinizat) este vizibil sub forma de corpuscul Barr in majoritatea tesuturilor (figura 1.4) sau sub forma de apendice nuclear (drumstick - bat de toba) pe frotiuri de sange, in polimorfonuclearele neutrofile (figura 1.5). Astfel, atat la femeie cat si la barbat, un singur cromozom X ramane activ, iar cromozomii X suplimentari sunt inactivati prin heterocromatinizare. Conform principiului Lyon, inactivarea cromozomului X este totala, se produce precoce in perioada embrionara si este definitiva; inactivarea cromozomului X se produce la intamplare, in unele celule fiind inactivat cromozomul X de origine paterna, iar in altele cel de origine materna.

Numarul de corpusculi Barr este egal cu suma cromozomilor X - 1.

Cromatina Y

La barbati (XY), cromatina sexuala este reprezentata de heterocromatina de la nivelul celor 2/3 distale ale bratului lung al cromozomului Y; poate fi vizualizata, prin coloratia cu quinacrina si examinare microscopica in lumina ultravioleta, sub forma unui corpuscul intens fluorescent, denumit si cromatina Y sau corpuscul F.

Numarul de corpusculi F este egal cu numarul cromozomilor Y.

3.1.3. Structura supramoleculara a cromatinei (ADN)

Impachetarea succesiva a ADN, care realizeaza o scurtare de circa 10.000 de ori a moleculei de ADN permite adaptarea materialului genetic la volumul mic al nucleului.

1. Primul nivel de organizare supramoleculara a cromatinei este filamentul nucleozomic (figura 1.7b) cu un diametru de 10 nm, denumit si fibra de 10 nm. Nucleozomul (figura 1.6) este un complex ADN - histone: un segment de ADN se infasoara de 1¾ ori in jurul unui octamer histonic, de forma cilindrica, alcatuit din cate doua molecule din histonele H_2A, H_2B, H₃, H_4. Nucleozomii sunt legati intre ei printr-un segment de ADN numit ADN de legatura sau ADN linker, care este asociat cu histona H₁. Se constituie astfel filamentul nucleozomic, asemanator cu un "sirag de margele".

2. Al doilea nivel de organizare a cromatinei este fibra de cromatina de 30 nm (figura 1.7c), care rezulta din spiralizarea sub forma de solenoid a fibrei de 10 nm. Aceasta structura este stabilizata de histona H₁ si contine 6 nucleozomi per tur de helix. Cromatina din nucleul interfazic are ca unitate de organizare fibra de cromatina de 30 nm.

3. Al treilea nivel de organizare a cromatinei este reprezentat de buclele de cromatina (figura 1.7d) cu un diametru de 300 nm, care rezulta prin plierea fibrei de cromatina de 30 nm. Fiecare bucla este atasata prin anumite regiuni la un schelet proteic central. Buclele de cromatina se spiralizeaza si condenseaza puternic la inceputul diviziunii, alcatuind cromatida unui cromozom (figura 1.7e) care, in metafaza, are un diametru de 700 nm. Fiecare cromatida a unui cromozom contine deci o singura molecula de ADN cu grade succesive de impachetare. La sfarsitul diviziunii, cromozomii se despiralizeaza.

3.2. Cromozomii umani

La inceputul diviziunii, cromatina se condenseaza in cromozomi, structuri nucleare colorate intens cu coloranti bazici.

Cromozomii au doua functii importante:

1. transporta materialului genetic de la o celula-mama la celulele fiice, precum si de la parinti la descendenti (prin gameti) in timpul multiplicarii celulare; in felul acesta, cromozomii asigura stabilitatea proceselor ereditare;

2. realizeaza amestecul materialului genetic intre diferitele generatii, prin procesele de recombinare din meioza, cea mai importanta sursa de variabilitate.

3.2.1. Numarul cromozomilor este caracteristic pentru fiecare specie: E. coli (1), ascaridul (2), tutunul (48), rosia (24), cartoful (48), ridichea (18), broasca (26), curcanul (82), gaina (78), Drosophila melanogaster (8), sobolanul (42), soarecele (40), pisica (38), cainele (78), magarul (62), calul (64), maimuta Rhesus (Macaca mulatta) (48), cimpanzeul (48), Homo sapiens (46).

Numarul cromozomilor nu exprima gradul de complexitate si evolutie biologica a organismelor si nu reprezinta un criteriu de clasificare a speciilor pe clase evolutive.

In mod normal, la om, celulele somatice (celule diploide), contin 46 de cromozomi, iar gametii (celule haploide), 23 de cromozomi. Prin fuzionarea a doi gameti haploizi in timpul fecundatiei se reface numarul diploid si se realizeaza 23 de perechi de cromozomi omologi, identici ca dimensiune, forma, continut genic, dar diferiti ca origine. 22 perechi de cromozomi reprezinta cromozomii somatici sau autozomii, identici la cele doua sexe; o pereche reprezinta cromozomii sexuali sau gonosomii, care difera la cele doua sexe: XX la femeie si XY la barbat. Cromozomii X si Y sunt omologi doar ca origine si functie, deosebindu-se morfologic.

3.2.2. Morfologia cromozomilor metafazici

Analiza corecta a morfologiei cromozomilor este realizata in metafaza diviziunii, cand acestia sunt bine individualizati si se afla in acelasi plan (placa ecuatoriala). In acest stadiu, cromozomii sunt alcatuiti din doua cromatide unite la nivelul centromerului (cromozomi bicromatidici) si delimitate la capete prin telomere (figura 1.8).

Unele elemente morfologice sunt comune tuturor cromozomilor, iar altele sunt comune numai unor cromozomi.

a) Elementele morfologice comune tuturor cromozomilor sunt cromatidele, centromerul si telomerele. Prezenta acestor structuri este obligatorie, ele fiind esentiale pentru replicarea si distributia egala a cromozomilor.

Cromatidele sunt structuri longitudinale identice (cromatide-surori). Fiecare cromatida contine o singura molecula de ADN asociata cu proteine.

Centromerul (cen) este regiunea cromozomiala in care sunt atasate cele doua cromatide, formand constrictia primara. In mod normal, fiecare cromozom are un singur centromer, constituit din ADN inalt repetitiv. La aceste secvente repetitive se leaga un complex de proteine cunoscut sub denumirea de kinetocor, cate unul pentru fiecare cromatida. Kinetocorul reprezinta locul de fixare a microtubulilor filamentelor fusului de diviziune, care asigura deplasarea cromatidelor la polii fusului in decursul anafazei. In lipsa centromerului (de exemplu, in cazul fragmentelor acentrice), nu este posibila atasarea la fusul mitotic si includerea in nucleu.

Centromerul imparte cromatidele in doua brate: bratul scurt notat cu p (petit) si bratul lung notat cu q (qeue). In functie de pozitia centromerului, constanta la fiecare cromozom, se descriu cromozomi (figura 1.9):

metacentrici, cu centromerul situat in mijlocul cromozo-mului si bratele aproximativ egale;

submetacentrici, cu centromerul situate in vecinatatea punctului median al cromozomului si brate de lungimi diferite;

acrocentrici, cu centromerul situat spre un capat al cromozomului.

Telomerele (t) sunt structurile situate la capetele cromozomului, formate din ADN si proteine. In structura telomerului exista un bloc de ADN repetitiv, in care o secventa scurta (5'-TTAGGG-3') se repeta in tandem de citeva mii de ori.

Principalele functii ale telomerelor sunt urmatoarele:

- mentin integritatea structurala a cromozomului; pierderea telomerelor genereaza capete cromozomiale instabile, "lipicioase", care au tendinta de a fuziona cu capetele altor cromozomi lipsiti de telomere, determinand diferite aberatii structurale;

- asigura o replicare completa a capetelor cromozomiale, proces realizat de o telomeraza (vezi Replicarea ADN).

b) Elementele morfologice comune anumitor cromozomi

Satelitii sunt mici mase de cromatina atasate la bratele scurte ale cromozomilor acrocentrici (exceptand cromozomul Y). Satelitii se ataseaza de restul cromozomului prin intermediul unor filamente ADN care contin genele pentru ARN ribozomal; deoarece ARNr este bine reprezentat in nucleol, aceste filamente sunt denumite organizatori nucleolari.

(2) Constrictiile secundare (h) sunt zone ingustate alcatuite din ADN repetitiv, prezente in vecinatatea centromerului pe bratul lung al cromozomilor 1, 9 si 16, precum si in regiunea mijlocie a bratelor lungi ai cromozomului Y.

Situsurile fragile sunt "lacune" necolorate, vizibile pe cromatidele cromozomilor; in vivo sau in anumite medii de cultura (de exemplu, utilizarea de inhibitori ai acidului folic), la nivelul situsurilor fragile cromozomii se pot rupe cu usurinta.

Pana in prezent au fost identificate peste 30 situsuri fragile considerate, in general, markeri normali; exceptie face situsul fragil FRAXA, situat pe bratul lung al cromozomului X, asociat cu sindromul X fragil, una dintre cele mai frecvente cauze de retard mental

3.2.3. Clasificarea cromozomilor umani

Cromozomii sunt identificati pe baza morfologiei lor. Ei sunt clasificati conform Sistemului international de nomenclatura citogenetica umana (International System of Human Cytogenetic Nomenclature - ISCN), adoptat in 1995.

Pe baza taliei si pozitiei centromerului, cromozomii au fost clasificati in 7 grupe, notate de la A la G; fiecare cromozom somatic este desemnat printr-un numar de la 1 la 22 (figura 1.10). Se obtine astfel o aranjare sistematizata a cromozomilor unei celule numita cariotip .

● Cromozomi mari sunt cromozomii grupei A (perechile 1-3), metacentrici (cromozomul 2 este mai submetacentric) si cromozomii grupei B (perechile 4-5), submetacentrici;

● Cromozomi mijlocii sunt cromozomii grupei C (perechile 6-12 si cromozomul X), submetacentrici, cromozomii grupei D (perechile 13-15), acrocentrici si cromozomul 16 (apartine grupei E ), metacentric;

● Cromozomi mici sunt cromozomii grupei F (perechile 19-20), metacentrici, perechile 17-18 (apartin grupei E), submetacentrici si cromozomii grupei G (perechile 21-22 si cromozomul Y), acrocentrici.

Conform ISCN, pentru a desemna un cariotip normal sau anormal, se mentioneaza in urmatoarea ordine si separati prin virgule: numarul de cromozomi, constitutia cromozomilor sexuali si anomaliile numerice sau structurale ale cromozomilor somatici (atunci cand sunt prezente). Prezenta unui mozaic cromozomial se noteaza mentionand cariotipurile liniilor celulare componente, separate printr-o diagonala (/) (pentru detalii - vezi Caiet lucrari practice).