FENOMENE LEGATE DE CRESTEREA PLANTELOR

FENOMENE LEGATE DE CRESTEREA PLANTELOR

Regenerarea

Regenerarea este procesul fiziologic prin care organismul se reface din parti izolate (tulpini cu muguri, radacini, frunze, calus, celule individualizate). Se formeaza tesuturi si organe noi, cu functii bine definite.

Regenerarea sta la baza inmultirii vegetative prin frunze, stoloni, marcote, butasi de tulpini, butasi de frunze. Altoirile au la baza tot un proces de regenerare a calusului dintre altoi si portaltoi.

Cultura de tesuturi sau cu suspensii de celule este o forma noua de inmultire vegetativa pe baza regenerarii, pornind de la meristeme, maduva tulpinii, floem, calus sau chiar dintr-o singura celula somatica.

Microinmultirea plantelor prin tehnica culturii de tesuturi 'in vitro'

Principiul metodei Tehnica culturii de tesuturi 'in vitro' face parte din biotehnologiile moderne ce prezinta largi aplicatii in agricultura, industria alimentara, farmaceutica, chimica si energetica, medicina si combaterea poluarii mediului. Principalele directii aplicative in agricultura sunt: inmultirea plantelor prin tehnici 'in vitro', obtinerea materialului de plantat liber de agenti patogeni, obtinerea de indivizi haploizi prin antogeneza si ginogeneza, crearea de noi genotipuri de plante, selectarea si cultivarea unor linii cu randament sporit de produsi secundari, conservarea fondului genetic in banci de gene etc.

Prin culturi de tesuturi vegetale 'in vitro' se intelege cultivarea pe medii nutritive artificiale, aseptice, a oricarei parti componente a unei plante, numite explant, sub forma de celule, tesuturi sau organe. Aceasta tehnologie se bazeaza pe faptul ca celula vegetala se supune principiului totipotentei si anume ca nucleul sau contine totalitatea informatiei genetice necesare dezvoltarii unui organism complet. Inmultirea plantelor 'in vitro' este o forma de inmultire vegetativa care asigura obtinerea unui randament sporit in comparatie cu alte procedee folosite, in special, in horticultura.

Materiale necesare: etuva, autoclav pentru sterilizarea mediilor si a instrumentarului, pH-metru, agitator mecanic, microscop stereoscopic, frigider, distilator de apa, sticlarie si instrumentar de laborator, boxe cu flux laminar steril sau nisa sterila cu instalatie de radiatii ultraviolete, tuburi fluorescente, termostat, umidometru, instalatii de aer conditionat.

Modul de lucru

a). Organizarea laboratorului de culturi de tesuturi.

Organizarea laboratorului de culturi de tesuturi necesita folosirea urmatoarelor incaperi:

- incaperile pentru mediile de cultura;

- incapere pentru spalarea si sterilizarea sticlariei, instrumentarului si a materialului vegetal;

- incapere aseptica, in care se izoleaza explantele si se fac inoculari;

- camera de crestere, in care au loc incubarea, cresterea si intretinerea culturilor;

- sera, in care se face aclimatizarea plantelor obtinute 'in vitro' in mediul septic.

b). Prepararea mediilor de cultura.

Mediile de cultura trebuie sa contina saruri minerale (macro si microelemente) compusi organici cu azot si carbon si substante de crestere (hormoni si vitamine). Unul dintre cele mai utilizate medii de cultura este mediul Murashige-Skoog (1962).

Prepararea mediului Muraschige-Skoog se face dupa urmatoarea schema:

Prepararea solutiei finale Muraschige-Skoog (ingredientele necesare prepararii unui litru de mediu) este urmatoarea:

NH₄NO₃ 1,650 mg

KNO₃ 1,900 mg

MgSO₄ x 7 H₂O 370 mg

KH₂PO₄ 170 mg

Fe EDTA 40 mg 5 ml solutie stoc

CaCl₂ x 2 H₂O 2,9 ml solutie stoc

microelemente 1 ml solutie stoc

KI 1 ml solutie stoc

vitamine 1 ml solutie stoc

zaharoza 30 g

A.I.A 1-30 mg

chinetina 0,04-10 mg

ajustarea pH-ului la 5,8 cu o,2 N KOH si 0,2 N NaOH

adaugarea Agarului..10 g (pentru mediile solide)

completarea mediului final la 100% ml cu apa distilata.

c). Sterilizarea si sterilitatea

O conditie exentiala in reusita culturilor 'in vitro' este asigurarea sterilitatii sticlariei si instrumentarului cu care se lucreaza, a mediilor de cultura, a materialului biologic din care se recolteaza explantele si a incintei in care se inoculeaza. Obiectele solide se sterilizeaza prin uscarea la etuva la 100⁰C, timp de 1-3 ore, urmata de autoclavare sau flambare. Mediile de cultura si apa distilata necesara spalarii se sterilizeaza prin autoclavare la 121⁰C, timp de 15-40 minute. Materialul vegetal se dezinfecteaza cu hipoclorit de Na sau Ca (2-10%) timp de 15-30 minute, alcool etilic, apa oxigenata, la care se adauga detergent lichid sau antibiotice, apoi se spala cu apa distilata de 3-5 ori. Camera de inoculare se sterilizeaza in instalatii de gaz si ultraviolete sau prin dotare cu boxe cu flux laminar steril.

d). Initierea unei culturi de tesuturi 'in vitro'

Alegerea materialului vegetal depinde de scopul urmarit si are la baza urmatoarele obiective:

- multiplicarea clonala rapida a unor exemplare valoroase folosind meristeme, componente florale sau organe vegetale;

- obtinerea de material saditor devirozat se face prin cultura de meristeme apicale sau laterale de dimensiuni foarte mici (0,20-0,25 mm);

- obtinerea de plante haploide se face prin culturi de antere, polen sau celule ale sacului embrionar;

- sporirea continutului de biomasa ce elaboreaza substantele bioactive se face prin culturi de celule;

- selectionarea unor linii rezistente la factori de stress, folosind explante provenite de la plantele rezistente la factorul stresant;

- producerea de hibrizi folosind culturi de protoplasti.

Izolarea explantelor. Pentru multiplicarea clonala se recolteaza de obicei explante din apexul tulpinii de 0,5-1 mm care sa contina meristeme apicale si cateva primordii foliare. Dimensionarea uniforma a explantelor se face cu un dispozitiv de inox tip ghilotina. Materialul vegetal utilizat este in prealabil sterilizat. Operatia se executa in boxa sterila, la microscopul stereoscopic.

Inocularea explantelor se face imediat dupa dimensionarea in medii lichide sau solide, in conditii de sterilitate perfecta. Culturile pe mediul lichid asigura accesibilitatea elementelor nutritive si aeratia, nu necesita respectarea polaritatii, dar se integreaza mult mai usor. Culturile pe mediul solid necesita respectarea orientarii polare, si anume bazala radiculara si superioara apicala, regenerarea facandu-se dupa modul clasic al butasirii.

Initierea culturii de tesuturi. Dupa inoculare, flacoanele cu mediul inoculat sunt trecute in camere de crestere si tinute intr-un regim climatizat, programat si controlat timp de 1-2 saptamani la plantele ierboase si de 6-8 saptamani la cele lemnoase. }esuturile inoculate pe medii nutritive sterile se vor difentia; mai intai formeaza calus, care apoi se transforma in meristem generativ de radacini si tulpini. Apexul tulpinii constituie astfel un microbutas, deoarece conul vegetativ inoculat 'in vitro' formeaza un sistem radicular propriu. Din aceasta cauza este frecvent folosit in microinmultirea accelerata a plantelor.

Explantul inoculat pe mediul aseptic este supus mai intai incubarii. Prin incubare se asigura conditii optime de supravietuire: intuneric, buna aeratie, regim termic de 25-27⁰C si umiditatea de 90-100%. Dupa inoculare explantul este introdus in conditii de crestere si dezvoltare. In aceasta faza lumina prezinta o importanta deosebita. Morfogeneza organelor este asigurata de intensitati luminoase scazute (cca 1000 lucsi), iar cresterea necesita intensitati luminoase mai ridicate (4000-10000 lucsi). Transferul pe mediul natural septic, in sera, necesita calirea materialului vegetal, care se realizeaza prin ridicarea intensitatii luminii sau prin tratamente cu temperaturi scazute (-2⁰C timp de 4-6 saptamani). Transferul se face pe pamant steril umectat cu solutie nutritiva. Plantele sunt protejate de stresul hidric prin acoperire cu recipiente transparente, la umiditatea de 100% (fig.127).

Interpretare. Prin tehnica culturii de tesuturi 'in vitro' se obtin rezultate foarte importante, de interes practic in horticultura, genetica, ameliorare, industria farmaceutica etc.

Durata experientei pana la 4-6 saptamani.

Punerea in evidenta a regenerarii la butasii de tulpini si de frunze

Materiale necesare butasi de tulpini de Ampelopsis, Salix sau Pelargonium, butasi de frunze de Begonia, vas de apa si vase cu nisip umed, lama de ras.

Modul de lucru Fragmente de ramuri desprinse de planta se introduc in nisip umed si se mentin cateva zile intr-o camera umeda, la regim temic optim. In acest interval de timp se va forma un strat de calus pe suprafata sectionata a butasului din care apar radacini adventive. La partea superioara, din mugurii axilari vor porni lastari cu frunze.

Pentru regenerarea butasilor de frunze, se ia o frunza de Begonia, care se asaza cu fata inferioara pe nisip umed, implantandu-se cu petiolul in nisip. In cateve locuri pe nervura centrala se fac taieturi cu lama de ras pe care se va forma calus, pe baza unei diviziuni a celulelor epidermice de pe fata superioara. Ulterior apar radacini adventive, apoi muguri care dau lastari si astfel intreaga planta este regenerata (fig. 128).

Durata experientei observarea 5 minute 2-3 saptamani.

Polaritatea

Polaritatea este insusirea plantelor de a forma la capetele opuse, organe diferite ca structura anatomo-morfologica. La polul inferior se vor forma radacini (pol rizogen), iar la polul superior apar muguri cu frunze (pol caulinar). Aceasta polaritate in repartitia organelor este o expresie a diferentierii functiilor si a specializarii organelor cu anumite functii.

Polaritatea ramurilor de Salix

Materiale necesare ramuri de salcie, camera umeda.

Modul de lucru Doua ramuri de salcie, lungi de 20-30 cm si cu diametrul de 10-12 mm, care poarta muguri sanatosi pe toata lungimea, se suspenda in atmosfera saturata cu vapori de apa dintr-o camera umeda. Unul din butasi se aseaza in pozitia normala (cu polul bazal in jos), iar celalalt butas se aseaza in pozitie inversa (cu polul bazal in sus).

Dupa pastrare timp de 3-4 saptamani, la intuneric in camera umeda si la regim termic optim, se constata ca mugurii adormiti de la polul bazal (rizogen) formeaza radacini, iar mugurii adventivi de la polul apical (caulinar) formeaza lastari cu frunze (fig. 1289.

Interpretare Indiferent de pozitia butasilor (normala sau inversa), nu se schimba functiile fiziologice ale celor doi poli ai butasilor, din care se vor forma noile organe ale plantei, in functie de specializarea acestora, imprimata genetic in insusirea de polaritate.

Corelatia si dominanta apicala.

Intre organele si tesuturile plantelor exista interactiuni fiziologice care conduc la cresterea armonioasa a tuturor partilor plantei, mentinand o rezerva de muguri pentru ciclurile urmatoare de vegetatie. Pornirea in crestere a acestor muguri dorminzi este declansata prin taierea mugurelui terminal, a varfului tulpinii sau a lastarului principal care exercita rolul de dominanta apicala.

Eliminarea dominantei apicale la plante

Materiale necesare ghivece cu plante de fasole, lama de ras.

Modul de lucru O parte din plantulele de fasole dintr-un ghiveci se lasa intacte (control), iar la o alta parte din plante se indeparteaza varful de crestere (mugurele terminal). Dupa 1-2 saptamani se constata la plantele de control, o continuare a cresterii in lungime a tulpinii, iar cotiledoanele se zbarcesc pana se usuca. La plantele cu mugurele terminal taiat cresterea in lungime inceteaza ,iar din mugurii dorminzi de la baza cotiledoanelor iau nastere doi lastari noi, care tind sa ia pozitie verticala (fig. 130).

Interpretare La planta control, mugurele terminal exercita o actiune de inhibare a mugurilor axilari, numita dominanta apicala. In cazul indepartarii varfului de crestere, dispare dominanta apicala iar mugurii axilari pot porni in vegetatie, preluand rolul de crestere in lungime a lastarului sau a plantei.

Rolul inhibitor exercitat de mugurele terminal se datoreste cantitatii foarte mari de auxina naturala care provine din varf si circula descendent, mentinand in stare de repaus mugurii axilari. Pe acest fenomen se bazeaza tehnica taierii arborilor si arbustilor.

Durata experientei observarea timp de 10 minute la interval de 1-2 saptamani.