CRIOPREZERVAREA DE TESUT OVARIAN

CRIOPREZERVAREA DE TESUT OVARIAN

-o fetita are la nastere aprox 2 mil ovocite in ovare

-la pubertate ramane cu 300 000.

-din aceste ovocite aprox 1000 degenereaza in fiecare luna si aprox 300 vor fi eliberate in viata reproductiva.

Femeia nu produce ovocite aditional ca si barbatul sperma; pt a extinde fertilitatea poate alege crioprezervare de ovocite sau tesut ovarian.

Transferul si crioprezervarea de tesut ovarian se poate face simplu prin microdisectia a 1mm din invelisul ext al ovarului care are foliculi in suprafata cu ovocite si nu a stratului intern care reprezinta o pulpa cu vase cu scopul de a hrani foliculii.

Apoi tesutul ovarian este supus unui proces computerizat de freezing gradual si pastrat pina cand femeia doreste sa aiba un copil.

-avantajul crioprezervarii de tesut ovarian fata de crioprezervarea de ovocite este ca toate ovocitele din tes ovarian pot fi extrase si inghetate intr-o procedura fara tratament hormonal, pe cand ovocitele se obtin si se congeleaza dupa o minima stimulare hormonala.

Crioprezervarea de ovocite

Evaluarea calitatii ovocitelor: stadiul nuclear; caracteristicile citoplasmei; aspectul coronei radiata; expansiunea celulelor cumulus.

-se ingheata intre 38-40 ore dupa hCG, metafaza II.

-cu crioprotectanti: alcooli, zaharuri si DMSO (dimetilsulfoxide).

Vitrificarea de ovocite

-o concentratie mare de crioprotectanti solidifica fara a face cristale de gheata.

Avantaje:

-evita formarea cristalelor de gheata.

Crioprezervarea de tesut ovarian

- Transferul si crioprezervarea de tesut ovarian-primele incercari in 1950

-din 1990 a devenit o procedura raspindita pt pacientele cu cancer ovarian inainte de chimioterapie sau radioterapie

-azi se foloseste atit pt pacientele cu cancer si la cele care doresc amanarea si pastrarea fertilitatii.

-donarea postmortem de tesut ovarian crioprezervarea lui si maturarea foliculilor in vitro

Recipientii

Recipientii:

-pacientele care si-au inghetat propriul tes ovarian si amana fertilitatea

-pacientele cu insuficienta ovariana prematura

-pacientele cu cancer ovarian.

Important

-varsta: max 35 ani (>60% din foliculii primordiali se pierd datorita ischemiei dinaintea revascularizarii dupa transplantare si prin dezghet se vor mai pierde 7%foliculi).

-colectarea de tesut ovarian: in faza foliculara per laparoscopic cu un devise de biopsie sau prin ooforectomie. Se transporta pe gheata.

Important 2

-marimea optima a tesutului ovarian: 1-2mm grosime si 1,5x0,5cm lungime.

-alegerea crioprotectantilor: propanendiol, etilenglicol sau DMSO. Se incubeaza tesutul la 4C 30min.

TRANSFERUL CITOPLASMATIC SI RECONSTRUCTIA OVOCITULUI

-Reconstructia ovocitului=Human nuclear transfer=Cytoplasmic nuclear transfer reprezinta transferul unei parti din oul unei femei in oul alteia. In acest se foloseste partea sanatoasa din oul donor pt a suplimenta partea defecta dintr-un ou recipient si a-l face sa supravietuiasca ca un ou sanatos.

E prezervata genetica femeii infertile pt ca 99% din materialul genetic este al ei, citoplasma donorului (care contine ADN mitocondrial da oului energie pt supravietuire si reprez 1% din genetica embrionului). Dupa formarea noului ou, acesta este fecundat cu sperma partenerului si embrionul este implantat in uterul femeii infertile.

-probleme etice, complicatii

CE ESTE TRANSFERUL NUCLEAR?

-Nucleul cat si mitocondria contin ADN.

-in sexualitatea normala copilul mosteneste ADN mitocondrial de la mama. Acest pattern de mostenire se numeste "maternal inheritance".

-Daca mama transmite o mitocondrie defecta copilului acesta poate avea afectiuni cardiace, musculare, hepatice, cerebrale. Singura metoda de a evita acest lucru este transferul nuclear care permite mamei transferul ADNului nuclear copilului ei, dar nu si a ADNului mitocondrial defect.

-transferul nuclear este un procedeu invaziv in care de la un ou in vitro fertilizat, nucleul (de la cei doi parinti) e transferat intr-un ou enucleat (celulele oului cu nucleul inlocuit, provenit de la al treilea= donorul).Aceasta duce la embrionul cu 3 parinti. Nucleul sau este format din fuziunea spermei cu nucleul oului si citoplasma lui provine de la un ou enucleat de la donor. Va avea ADN din 3 surse diferite: ADN nuclear de la mama si tata si ADN citoplasmatic de la donor. 

VITRIFICAREA OVOCITELOR

Crioprezervarea poate fi asigurata prin:

-inghetare lenta (slow cooling)

-vitrificare.

Rata coolingului si crioprotectantii folositi sint f imp.

CRIOPREZERVAREA CONVENTIONALA

Necesita

-echipamente costisitoare

-timp mai lung decat vitrificarea.

Pot apare:

-afectarea embrionului prin formarea de cristale de gheata care afecteaza embrionul.

VITRIFICAREA

-o tehnica noua, delicata

-celulele si tesuturile sint plasate direct in solutia de vitrificare dupa echilibrarea punctului critic cu crioprotectanti, apoi pasarea lor in azot lichid.

AVANTAJELE VITRIFICARII

-Nu se formeaza cristale de gheata (temp creste rapid si avanseaza rata de racire reducand afectarea prin inghet

-fol putini crioprotectanti

-timp de expunere minim

-procentul de supravietuire este mai mare decat prin crioprezervarea conventionala

VITRIFICAREA-METODA RAPIDA DE INGHETARE PT EMBRIONI SI OVOCITE

-Astazi cuplurile sau singles doresc sa aiba o familie tirziu (intii cariera, calatorii, case apoi copii dupa 35-38 ani)

-din fericire azi femeile pot ingheta ovocitele si cuplurile pot ingheta embrionii pt mai tirziu.

STEM CELL

-una din cele mai fascinante arii din biologie

-2 caracteristici:

1.cel nespecializate care se reinoiesc pt o luga perioada de timp prin diviziune celulara

2.in conditii fiziologice sau experimentale ele pot fi induse a fi celule cu fc speciale cum ar fi cel musculare cardiace, cel producatoare de insulina pancreatice etc.

STEM CELL

Cercetatorii lucreaza cu 2 tipuri de cel stem:

-embrionic stem cells de la animale sau oameni

-cel stem adulte care au fc si caracteristici diferite

In 1998 s-au izolat cel stem umane de la embrioni si s-au cultivat in laborator (embrionic stem cells umane). Embrionii au fost creati pt cercetare sau donati de cupluri pt cercetare.

STEM CELL-PROPRIETATI

Difera de restul celulelor prin:

-se divid si regenereaza singure timp indelungat

-nu sunt specializate

-pot da nastere la cel specializate

Azi se studiaza :

-de ce cel stem embrionare prolifereaza peste un an in laborator fara sa se diferentieze pe cand cel stem adulte nu pot

-care sunt factorii din organism care regleaza proliferarea de cel stem si diferentierea

Raspunzand la aceste intrebari e posibil sa intelegem cum proliferarea celulara este reglata intr-o dezvoltare embrionara normala sau nu intr-o diviziune celulara anormala care duce la cancer.

CELULELE STEM SUNT NESPECIALIZATE

Cel stem nu au structuri specializate care le permit anumite functii.

O cel stem nespecializata poate duce la cel specializate cum ar fi cel musculare cardiace, cel sanguine, sau cel nervoase.

STEM CELLS SUNT CAPABILE DE DIVIZIUNE SI REGENERARE TIMP LUNG

-Fata de cel musculare cardiace, sanguine sau nervoase (care nu se autoreplica), cel stem se pot replica de nenumarate ori. Cand cel stem sunt replicate de nenumarate ori se numeste proliferare. Daca cel stem se replica in mil de cel stem nespecializate ca parintii stem cell, se numeste ca aceste cel vor fi capabile de regenerare pe timp lung.

STEM CELLS POT DA NASTERE CELULELOR SPECIALIZATE

Cand cel stem nespecializate dau nastere cel specializate procesul se numeste diferentiere.

Semnalul intern celular e controlat de genele celulare care sunt situate in lanturile ADN si duce instructii codate pt toate structurile si functiile celulare.

Semnalul extern cel pt diferentierea celulara include secretiile chimice de catre alte celule

Cel stem adulte genereaza tipuri cel din tes din care rezulta

De asemenea cel stem dintr-un tesut pot genera cel stem de alt tip (ex: cel sang pot deveni neuroni). Fenomenul se numeste plasticitate.

-se fol cel stem adulte pt terapia bazata pe cel stem.

CE SUNT CEL STEM EMBRIONARE?

-Din embr rez in lab, dupa IVF pt cercetare. Embrionii au 4-5z=blastocist:

-trofoblastul (str de celule care inconjoara blastocistul)

-blastocelul (cavitatea)

-inner cell mass (un grup de aprox 30 cel intr-o parte a blastocelului)

Cum se cresc cel stem embr in lab?

Cresterea cel in laborator se numeste cultura celulara.

Inner cel mass se transfera in lab intr-un mediu de cultura. Cel se divid si se imprastie la suprafata vasului. Aceste cel se vor atasa de cel de soarece care le vor hrani. Recent oamenii de stiinta au crescut celule stem si fara cel de soarece (virusi si macromolecule).

Celulele embrionare stem care prolifereaza in cultura pt 6 luni fara diferentiere sunt pluripotente si sunt genetic normale se numesc linia de cel embrionare stem. Aceste linii celulare se ingheata si se trimit la alte laboratoare pt cercetare.

Teste de identificare a stem cells

-cresc si cultiva cel stem, microscopic se verifica sanatatea si nediferentierea

-det markerilor de supraf care sunt numai pe cel nediferentiate. Alt test e proteina Oct-4

(factor transcriptor) care schimba genele, lucru fol in procesul de diferentiere celulara si dezvoltare embrionara.

-ex cromozomilor la microscop (daca cromoz sunt afectati sau numarul cromozomilor s-a schimbat). Nu detecteaza mutatiile genetice in celule.

Teste de identificare a stem cells 2

-sa determine daca celulele pot fi subcultivate dupa freezing, dezghet sau inlocuite

-teste pt det daca cel stem embrionare umane sunt pluripotente prin: 1.permite cel sa se diferentieze spontan in culturi cel; 2.manipulind cel sa se diferentieze in tipuri cel specifice; 3.inj cel intr-un soarece imunosuprimat pt testarea formarii teratoamelor (Tb)=mixtura de cel diferentiate.

Cum sunt stimulate cel stem embr sa se diferentieze

-daca cel se aduna impreuna in corpuri embrioide incep sa se diferentieze spontan. Pot forma celule musculare, celule nervoase sau alte tipuri celulare. Diferentierea spontana este un indicator de sanatate a culturii de celule stem.

-cercetatorii incearca sa controleze diferentierea cel stem embrionare: modif compozitia chimica a mediului sau insera gene specifice (scop- de a trata anumite boli: Parkinson, diabet, afectiuni ale maduvei spinarii, degenerari de celule Purkinje, distrofie musculara Duchenne, boli cardiace sau pierderea vederii sau auzului).