Metabolismul proteinelor. Aminoacizii si proteinele. Nucleotide.

PROTEINE

Raspandirea in natura si clasificare

Proteinele sunt componente de baza ale tuturor celulelor vii, alaturi de lipide, zaharide, vitamine, enzime, apa si saruri anorganice, formand impreuna un sistem complex in cadrul caruia se petrec o serie de reactii chimice care asigura reproducerea, dezvoltarea si functionarea normala a fiintelor vii.

Sunt componente ale structurilor celulare si au functii biologice fundamentale: enzimatice, hormonale, imunologice.

unt proteine unele substante cu puternica activitate biologica ale celulelor ca: enzimele, pigmentii respiratori, multi hormoni si anticorpii. Substanta contractila din fibrele musculare, din cilii si din flagelii organismelor inferioare, care poseda proprietatea de a transforma energia chimica in energie mecanica, este de asemenea o proteina.

Ele intra in structura tuturor celulelor, si ajuta la cresterea si refacerea celulelor.

Ca aspect, la microscop, proteinele sunt subtiri, ca niste bastonase gelatinoase. In organele animale apar sub forma de muschi , piele, par. Ele se gasesc si in plante, in cantitati mai mici.

Toate sunt amestecuri de compusi complecsi, continand carbon, hidrogen, azot, oxigen, uneori si fosfor, fier, iar de multe ori sulf.

Proteinele sunt principali constituenti ai corpului animalelor. Indeplinind o mare varietate de functii, se descopera o diversificare deosebita in alcatuirea lor. S-a demonstrat ca proteinele constituie partea cea mai insemnata din substanta uscata a celulelor. In corpul omenesc, 15 % din greutate se datoreaza proteinelor.

Analiza lor elementara a fost facuta de chimistul olandez Gerardus Iohannes Mulder (1802 - 188), extragandu-le din tesuturi animale si vegetale. Acesta le-a dat, in anul 1838, la sugestia fostului sau profesor J.J. Berzelius, numele de proteine, de la grecescul  protos  , care inseamna primul, in prima linie. Mulder publica aceasta denumire in 1840 ( in unele tratate apare anul 184 ), in limba olandeza, tradusa apoi si in limba franceza.

Caracteristica cea mai importanta a proteinelor este specificitatea: proteinele diferitelor specii vegetale si animale se deosebesc intre ele, existand deosebiri chiar si intre proteinele indivizilor din aceeasi specie. Se apreciaza ca intr-un organism animal exista circa 100.000 de proteinele specifice. Fiecare macromolecula de proteina este alcatuita din 50 pana la 10.000 de unitati de α- aminoacizi, unite prin legaturi peptidice.

1.2. Clasificarea proteinelor

Dupa sursa de provenienta:

- proteine de origine vegetala

- proteine de origine animala

Dupa solubilitatea in apa si in solutii de electroliti:

- insolubile (fibroase)

- solubile (globulare)

Dupa produsii rezultati la hidroliza totala:

- proteine propriu-zise (dau prin hidroliza totala numai α- aminoacizi)

- proteine conjugate sau proteide (prin hidroliza totala se obtine, pe langa α- aminoacizi, si o alta substanta, care in structura proteinei apare ca grupa prostetica)

1.3. Compozitia proteinelor

Compozitia diferitelor proteine este relativ asemanatoare. Toate proteinele contin elementele: C, H, O, N si S; in unele proteine se mai gasesc, in cantitati mici: P, Fe, Cu, I, Cl, si Br. Continutul procentual al elementelor principale este de: C 50-52 %, H 6,8-7,7 %, S 0,5-2 %, N 15-18 %.

Pentru stabilirea structurii proteinelor s-a recurs la metode de hidroliza. Prin hidroliza, proteinele se transforma in aminoacizi. Hidroliza proteinelor se poate efectua cu acizi, cu baze sau cu enzime. Hidroliza acida se face prin fierbere indelungata (12-48 ore) cu acid clorhidric de 20% sau mai bine cu acid formic continand HCl (2 ore). Hidroliza cu hidroxizi alcalini sau cu hidroxid de bariu are loc intr-un timp mai scurt. Prin hidroliza se obtine un amestec care poate sa contina circa 20 L-aminoacizi. Se formeaza si amoniac prin hidroliza grupelor CONH2 ale asparaginei si glutaminei.

Dupa E. Fischer (1902), proteinele sunt formate din resturi de aminoacizi, unite prin legaturi peptidice, CO-NH:

H2N - CH - CO - NH - CH - CO.NH - CH - COOH

I I I

R1 R2 R3

Fiecare catena polipeptidica a unei proteine este formata dintr-un anumit numar de resturi de amino-acizi, dispusi intr-o succesiune determinata.

Se observa ca la formarea polipeptidei intervin numai grupele functionale in pozitii a; chiar daca aminoacidul este un acid dicarboxilic sau o diamina, a doua grupare functionala COOH sau NH2 este cuprinsa in catenele laterale (R1,R2,. Rn). Catenele laterale pot fi formate din resturi nepolare sau polare. Structura lor este una din cauzele varietatii proteinelor.

1.4. Structura proteinelor naturale

Numarul proteinelor existente in natura este foarte mare; fiecare specie animala sau vegetala are proteinele ei specifice. De aceea, este destul de greu sa se stabileasca structura proteinelor, cu atat mai mult cu cat ele se transforma cu usurinta sub actiunea diferitilor agenti fizici si chimici.

Se disting patru grade structurale sau niveluri de organizare dupa complexitatea lor. Acestea au fost numite structuri primare, secundare, tertiare si cuaternare.

Structura primara a unei proteine este determinata prin numarul si succesiunea specifica a aminoacizilor din catena polipeptidica.

Structura secundara a unei proteine este determinata de aranjarea in spatiu a catenei polipeptidice si de legaturile care se stabilesc intre catene. Cercetarile in domeniu au sugerat ca macromolecula peptidica nu are forma extinsa, ci adopta o forma rasucita sau incretita.

Structurile tertiare: structurile secundare sunt determinate de legaturile de hidrogen dintre grupele CO si NH ale catenelor polipeptidice. Intr-o elice L foarte lunga, se pot stabili legaturi slabe, dar numeroase, si intre grupele R proeminente spre exterior, ale aminoacizilor. Sunt folosite 4 feluri de legaturi intre grupe R apartinand aceleiasi catene polipeptidice prin care se poate realiza o structura tertiara. La adoptarea si mentinerea unei anumite conformatii tertiare contribuie uneori ioni metalici sau, in proteide, grupele prostetice.

Un model de structura tertiara este aceea a mioglobinei; iar un model de structura secundara este acela al keratinei.

Mai multe asemenea structuri tertiare sunt asociate intre ele formand structuri cuaternare. Fortele de atractie sunt aceleasi ca in structurile tertiare, dar ele actioneaza in acest caz intermolecular, unind catene polipeptidice sau elice L-diferite. Un exemplu de structura cuaternara este acela al hemoglobinei.

Cercetarile efectuate in ultimii ani pentru stabilirea structurii chimice si conformatiei unor proteine au dat rezultate deosebit de satisfacatoare. Astfel, un pas inainte in acest domeniu reprezinta stabilirea secventelor de amino-acizi, adica a formulelor chimice pentru catenele polipeptidice in insulina, hemoglobina si alte proteine. S-a stabilit apoi modelul elicoidal pentru formarea catenelor poilpetidice in a-proteine, iar unul din cele mai frumoase progrese in biologia moleculara este lamurirea (cu ajutorul spectrelor de raze X) a conformatiei proteinelor mioglobina si hemoglobina. Cu toate aceste realizari, structura majoritatii proteinelor este inca insuficient cunoscuta si prezinta un vast domeniu de cercetare pentru multi oameni de stiinta. Cunoasterea ei va ajuta la intelegerea mecanismului celulei vii si va deschide calea pentru mari progrese in biologie si medicina.

1.5. Asimilatia si sinteza proteinelor

Se gasesc proteine in fiecare celula vie. Pentru sinteza lor, respectiv a aminoacizilor care le compun, plantele se folosesc de combinatii anorganice ale azotului, amoniac si azotati, pe care le extrag din sol. Unele vietuitoare inferioare, bacteriile de sol, pot folosi chiar azotul molecular.

Animalele nu au proprietatea de a asimila combinatiile anorganice ale azotului, ci sunt nevoite sa utilizeze proteinele de origine animala sau vegetala, continute in hrana lor. Proteinele nu pot fi intrebuintate ca atare, ci sunt hidrolizate in timpul digestiei, pana la aminoacizi. Acestia difuzeaza prin peretele intestinului in sange si servesc apoi celulelor pentru sinteza proteinelor proprii ale organismului. Numai datorita acestui mecanism, fiecare celula isi poate construi proteina ei specifica.

Organismul animal nu poate sintetiza decat anumiti aminoacizi; altii provin din proteinele hranei. De aceea, nu este suficient ca hrana animalelor sa contina o anumita cantitate de proteine, ci acestea trebuie sa cuprinda o cant. suficienta din fiecare aminoacid esential. Proteinele din lapte, carne, peste, oua, creier, serum, fibrina, soia si din embrionul de grau contin aminoacizii esentiali in proportie adecvata. In schimb, hemoglobina, gelatina si multe proteine din vegetale sunt deficiente in unul sau altul din aminoacizii esentiali. Folosirea exclusiva in alimentatie a acestor proteine duce la tulburari grave. Lipsa aminoacizilor esentiali din proteinele hranei se manifesta la animalele tinere a caror crestere inceteaza sau este incetinita. Simptomele de deficienta dispar daca se completeaza dieta cu lapte.

1.6. Izolarea si purificarea

Proteinele insolubile pot fi usor separate de compusii care le insotesc in organismele animale, grasimi, hidrati de carbon sau proteine solubile, asa ca izolarea lor nu prezinta dificultati. Din cauza insolubilitatii lor, nu pot fi purificate prin dizolvare.

Proteinele solubile sufera usor la incalzire, sau sub actiunea acizilor, a bazelor, a dizolvantilor organici si a altor compusi chimici, o transformare numita denaturare, prin care se pierde activitatea biologica specifica. Denaturarea proteinelor consta in modificarea ireversibila a formei lor spatiale, naturale, in urma desfacerii unor legaturi din structura moleculei proteice. Aceste modificari se produc fie sub actiunea unor agenti fizici (caldura, radiatii, ultrasunete) fie sub actiunea unor agenti chimici (solutii de acizi, baze sau saruri, solventi organici etc.)

Proteina se extrage din materialele biologice in care se gaseste cu o solutie salina, mai rar cu dizolvanti organici ca glicerina sau acetona, diluate cu apa. Solutiile acestea contin si substante neproteice; indepartarea acestora se face cu ajutorul dializei prin membrane permeabile pentru aceste substante dar impermeabile pentru proteine. Proteinele insolubile in apa distilata se precipita la sfarsitul dializei. Indepartarea ionilor straini poate fi accelerata prin suprapunerea unei electrolize, intr-un dispozitiv special (electrodializa).

Metoda obisnuita pentru obtinerea proteinelor din solutiile purificate prin dializa consta in precipitare cu saruri neutre, sulfat de amoniu sau sulfat de sodiu, in stare solida sau in solutie saturata. Dupa un alt procedeu, precipitarea proteinei se face cu etanol.

1.7. Proprietatile fizice

Din punct de vedere al solubilitatii, unele proteine sunt solubile in apa sau in solutii diluate de electroliti (de exemplu globulinele sau albuminele), iar altele sun insolubile in acesti dizolvanti (de ex. keratina sau colagenul).

Proteinele solubile formeaza solutii in care toate particulele dizolvate au aceeasi marime (solutii monodisperse). Unele proteine insolubile, prin incalzire prelungita in apa, se pot si ele solubiliza. In modul acesta, colagenul, dupa ce se imbiba, se dizolva transformandu-se in gelatina, care se dizolva prin slaba incalzire cu apa.

Masele moleculare ale proteinelor sunt foarte variate, de la zeci de mii la milioane. S-a constatat insaa ca foarte multe macromolecule de proteina sunt formate in realitate din asociatia mai multor catene polipeptidice, prin forte intermoleculare (forte de coeziune sau legaturi de hidrogen).

1.8. Proprietati chimice

Proteinele sunt amfiioni macromoleculari. Ca si la aminoacizi, punctul izoelectric este o constanta caracteristica proteinei respective. Fiind amfiioni, proteinele pot neutraliza atat acizi, cat si baze, deci au proprietati de tampon.

Reactii de identificare

Proteinele dau o serie de reactii de culoare folosite pentru identificare. Cele mai importante sunt urmatoarele:

Reactia biuretica consta in aparitia unei coloratii violete la tratarea cu o solutie de sulfat de cupru.

Reactia xantoproteica consta in aparitia unei coloratii galbene intense la tratarea solutiei de proteina cu acid azotic concentrat.

Reactia Millon consta in aparitia unui precipitat de culoare rosie la tratarea proteinelor cu o solutie concentrata de azotat mercuric in acid azotic ce contine si acid azotos.

Reactia Adamkiewiez-Hopkins consta in aparitia unei coloratii albastre-violete la tratarea proteinei cu acid sulfuric care contine si acid glioxilic.

Reacttia Pauly consta in aparitia unei coloratii rosii la tratarea cu acid diazobenzensulfuric a unei solutii de proteina alcanizata cu carbonat de sodiu.

1.9. Rolul proteinelor in organism

a. Plastic.

b. Functional (realizeaza presiunea oncotica; participa la echilibrul acido-bazic; participa la constituirea enzimelor; hormonilor; constituie receptori membranari, intra in constitutia altor substante active etc.).

c. Aparare (refacerea tesuturilor lovite, anticorpi; troficitate a celulelor sistemelor de aparare specific si nespecific; creste rezistenta fata de actiunea nociva a unor substante toxice: Pb, Hg, Cd, Cr, Se, As, benzen, toluen, amine, nitrobenzen, cloroform, CCl4, pesticide organoclorurate, sulfamide, antibiotice toxice - tetraciclina, saruri de Au s.a.).

d. Energetic - prin ardere dau 4,1 Kcal/g proteine; nu ard complet dand nastere unor substante toxice (amine toxice: indol, triptamina, histamina) care cer un efort hepatic suplimentar.

Necesarul de proteine

Alimentatia rationala recomand ingerarea in 24 ore a 1 g de proteine la 1 kg de greutate corporala. Asadar, o persoana cu masa corpului de 70 kg are nevoie zilnic de 70 g de proteine. Aportul minim de proteine nu trebuie totusi sa fie mai mic de 40 g zilnic. O cantitate de proteine sub acest indice are drept consecinta faptul ca organismul isi consuma proteinele tesuturilor. In unele situatii organismul necesita cantitati crescute de proteine. Valoarea energetica a proteinelor trebuie sa constituie 10-15 % din totalul de calorii pe care il contine ratia alimentara. In lume nu sunt conceptii unice despre normele fiziologice ale organismului in proteine. Pentru un barbat cu masa corpului de 70 kg in varsta de 18-40 ani ce nu depune efort fizic greu si locuieste in tara cu clima moderata necesitatea in proteine variaza intre 55 g (Canada), 87 g (Rusia) si 120 g (Bulgaria). Aceste varietati se afla in functie de calitatea si valoarea biologica a produselor consumate.

Necesarul de proteine depinde de necesitatile organismului:

Cantitativ:

Copii: 0-6 ani - 3-4 g prot / kg corp / 24 h
7-12 ani - 2-3 g prot / kg corp / 24 h
12-20 ani - 1,5-1,7 g prot / kg corp / 24 h

Adulti: 1,2-1,5 g prot / kg copr / 24 h

(ex: 75 kg - 85-105 g proteine / zi)
Gravidele si mamele care alapteaza: 2 g / kgc / zi
Sportivii, muncitoruaii, refaceri musculare: 2-3 g / kgc / zi

Surse de proteine

- Produse animale: lapte, branzeturi (100g branza = 25-30 g proteine), carne, viscere (ficat, rinichi, inima, splina, peste), oua.
- Leguminoase: fasole, mazare, soia.
- Cereale: paine.
- Nuci, arahide, alune, cartofi, ciuperci, legume, fructe (ultimele 2 mai putin).

Proteinele se gasesc in alimente in urmatoarele procente: carnea (20%), pestele (18%), ouale (12,7%), branza de vaci (18%), cascavalul (30%), soia (35%), fasolea (21%), nucile (18%), painea (8%), pastele fainoase (11%).

1.10. Reprezentanti

Proteinele fibroase se gasesc in organismul animal in stare solida si confera tesuturilor rezistenta mecanica (proteine de schelet) sau protectie impotriva agentilor exteriori.

KERATINELE- proteinele din epiderma, par, pene, unghii, copite si coarne se disting printr-un continut mare de sulf. Keratinele sunt insolubile in apa atat rece cat si calda, precum si in solutii saline. Din cauza aceasta keratinele prezinta o mare inertie fata de agentii chimici, precum si fata de enzime.

FIBROINA, componenta fibroasa din matasea naturala, se gaseste in acest material inconjurata cu o componenta amorfa, cleioasa, sericina, care reprezinta cca. 30 % din greutatea totala. In cele doua glande ale viermelui de matase, proteinele sunt continute sub forma de solutie concentrata, vascoasa.

COLAGENUL, este componenta principala a tesuturilor conjunctive, tendoanelor, ligamentelor, cartilajelor, pielii, oaselor, solzilor de peste. Exista numeroase varietati de colagen. Colagenul are o compozitie deosebita de a keratinei si fibroinei, caci este bogat in glicol, prolina si hidroxiprolina, nu contine cistina si triptofan. Prin incalzire prelungita cu apa, colagenul intai se imbiba, apoi se dizolva transformandu-se in gelatina sau clei.

ELASTINA constituie tesutul fibros, cu o elasticitate comparabila cu a cauciucului, a arterelor si a unora din tendoane, cum este de exemplu tendonul de la ceafa boului. Elastina nu se transforma in gelatina la fierbere cu apa si este digerata de tripsina. Ca si colagenul, fibrele de elastina sunt compuse din aminoacizi simpli, mai ales leucina, glicocol si prolina.

In regnul vegetal nu se gasesc proteine fibroase; functia lor este indeplinita in plante de celuloza. Proteinele fibroase se dizolva numai in acizi si baze concentrate, la cald, dar aceasta dizolvare este insotita de o degradare a macromoleculelor; din solutiile obtinute nu se mai regenereaza proteina initiala. Proteinele fibroase nu sunt hidrolizate de enzimele implicate in digestie si deci nu au valoare nutritiva.

Proteinele solubile sau globulare apar in celule in stare dizolvata sau sub forma de geluri hidratate. Ele au insusiri fiziologice specifice si se subimpart in albumine si globuline.

Albuminele sunt solubile in apa si in solutii diluate de electroliti (acizi, baze, saruri), iar globulinele sunt solubile numai in solutii de electroliti.

Exemple de proteine solubile:

albuminele din oua

caseina din lapte

globulinele si albuminele din sange (hemoglobina, fibrinogenul)

proteinele din muschi (miogenul si miosina)

proteinele din cereale (gluteina din grau, zeina din porumb)

proteinele produse de virusi (antigeni) si bacterii

Structura unei albumine

anticorpii

nucleoproteidele

enzimele

hormonii proteici (insulina)

Proteinele din sange

Sangele este o suspensie a unor corpuscule mari, vizibile la microscop, globulele albe si rosii, intr-un lichid omogen numit plasma. Globulele rosii contin toata proteina colorata rosie, hemoglobina. Plasma contine in solutie fibrinogenul, globuline si albumine. Lichidul ramas la indepartarea globulelor si a fibrinogenului se numeste serul sanguin. Coagularea sangelui se datoreaza transformarii fibrinogenului intr-un gel ireversibil, fibrina.

Globulinele din ser pot fi separate in trei fractiuni, L-, B si z. O importanta deosebita o constituie z-globulinele, care s-au dovedit identice cu anticorpii din serul sanguin.

Se stie ca in urma infectiilor cu bacterii sau virusuri, organismul animal devine imun, un timp mai lung sau mai scurt, fata de o noua infectie cu acelasi germen patogen. Imunitatea se datoreaza aparitiei de anticorpi in serul animalului infectat. Substantele care determina formarea anticorpilor, numite antigeni, sunt proteine, produse de bacterii sau provenite din acestea sau din virusuri prin dezagregarea lor. Orice proteina straina introdusa prin injectie in organism actioneaza ca antigen.

Proteinele din muschi

Muschii vertebratelor contin 15-20% proteine. Au fost izolate: miogenul, miosina, globulina X, stroma musculara, tropomiosina si actina.

Miogenul este un amestec de cel putin 3 proteine, cu caracter de albumine si globuline. Miogenul contine enzimele esentiale ale muschiului: fosforilaza, fosfoglucomutaza, etc..

Miosina si actina sunt proteinele care asigura functiunea contractila a muschiului. Tropomiosina este o proteina unitara.

Proteinele vegetale

Globulinele vegetale sunt mult raspandite in natura, alaturi de albumine. De exemplu globulinele din semintele oleaginoase: edestina, din samanta de canepa, excelsina din nuca braziliana, amandina din migdale si corilina din alune, apoi globulinele din leguminoase, de ex.: faseolina din fasole, legumina din mazare, precum si globulinele din cartofi, tomate, spanac etc. Toate au configuratii globulare.

Proprietatea graului de a da o faina panificabila se datoreaza caracterului special al proteinelor din endospermul, bogat in amidon, al semintelor acestei cereale. Proteina din grau, glutenul, se obtine prin framantarea fainii intr-un curent de apa; acesta antreneaza granulele de amidon, lasand glutenul sub forma unei mase lipicioase. Spre deosebire de celelalte proteine vegetale, glutenul este insolubil in apa si in solutii saline. Cercetarea clasica a glutenului a dus la concluzia ca el este un amestec de doua proteine: glutenina si gliadina. Cea din urma este singura proteina solubila in alcool de 70 % si poate astfel fi separata de glutenina.

Din punct de vedere al constitutiei, majoritatea proteinele solubile fac parte din categoria proteinelor conjugate, in care grupa prostetica poate fi o lipida (lipoproteide), acid fosforic (fosfoproteide), un metal (metaloproteide) sau un acid nucleic (nucleoproteide).

AMINOACIZII

1. Definitie

Aminoacizii sunt unitatile constituente ale proteinelor si cuprind in molecula lor doua grupari functionale: carboxil si amino.

Exista 20 de aminoacizi proteinogeni specificati prin codul genetic, prezenti in toate organismele vii.

Aminoacizii naturali au formula generala:

R-CH-COOH

NH2

in care gruparea aminica se afla la carbonul a fata de carboxil.

Exceptie face prolina al carui azot,desi tot in pozitia a fata de carboxil, face parte dintr-un inel pirolidinic, fiind o grupa aminica secundara.

Diversitatea aminoacizilor naturali este data de natura lui R care poate fi o catena hidrocarbonata alifatica sau aromatica, un heterociclu sau care poate sa cuprinda o functie aditionala.

2. Clasificare

Aminoacizii pot fi clasificati:

dupa natura catenei: alifatica, aromatica, heterociclica;

dupa numarul gruparilor -COOH si -NH2: monoamino-monocarboxilici, diaminomonocarboxilici;

dupa pozitia relativa pe care o au gruparilor functionale in molecula:a b g-aminoacizi.

dupa prezenta in cuprinsul catenei a altor grupari functionale.

Cea mai interesanta clasificare ni se pare a fi cea bazata pe polaritatea catenei si cuprinde patru grupe 1.) cu radical nepolar ( hidrofob ) : glicina, alanina, valina, leucina, izoleucina, prolina, fenilalanina, triptofanul si metionina.

Toti sunt mai putin solubili in apa decat aminoacizii polari;

2.) cu radical polar neincarcat electric (la pH=6): serina, treonina, cisteina, tirosina asparagina, glutamina. Acesti aminoacizi sunt mai solubili in apa decat cei nepolari, deoarece catena poate stabili legaturi de hidrogen cu apa, datorita gruparilor -OH, -NH2 amidice si -SH pe care le contine;

3.) cu radical polar incarcat negativ (la pH=6): acidul aspartic si acidul glutamic;

4.)cu radical polar incarcat pozitiv (la pH=6): lisina,arginina,histidina.

In afara acestor 20 de aminoacizi uzuali s-au izolat un numar de aminoacizi noi din hidrolizatul unor proteine foarte specializate, toti derivand din aminoacizii uzuali. Astfel, 4-hidroxiprolina a fost gasita intr-o proteina fibroasa,colagen si unele proteine vegetale; 5-hidroxilisina in colagen;desmosina si izodesmosina in elastina.(Stucturile acestor ultimi doi aminoacizi pot fi considerate ca fiind formate din 4 molecule de lisina,cu catenele laterale unite intr-un nucleu de piridiniu substituit.Aceasta structura permite desmosinei si izodesmosinei sa lege patru lanturi peptidice in structuri radiare. Elastina difera de alte proteine fibroase prin capacitatea sa de a suporta tensiuni in doua directii).

In anumite proteine musculare s-au gasit unii derivati metilati ai aminoacizii uzuali cum sunt : e-N-metillisina, e-N-trimetillisina si metilhistidina. Recent s-a descoperit prezenta in protrombina a acidului g-carboxiglutamic, cu importanta biologica considerabila. Se mai pot gasi si alti aminoacizi in hidrolizatele proteice, dar numarul lor trebuie sa fie mic, tinand seama de cunostintele genetice actuale, iar distributia lor se va limita la o proteina data. Aminoacizii rari din proteine se disting de cei uzuali prin faptul ca nu au o codificare prin triplet de baze (codon).In toate cazurile cunoscute ei sunt derivati ai celor uzuali si se formeaza dupa ce acestia au fost deja inserati in lantul polipeptidic,in procesul de biosinteza a proteinelor.

In diferite celule si tesuturi s-au pus in evidenta inca circa 150 de aminoacizi in forma libera sau combinatii,care nu se gasesc in proteine. Majoritatea dintre ei sunt derivati ai a-aminoacizilor din proteine; unii au insa gruparea amino la carbonul b g sau d fata de carboxil. Importanta biochimica ca intermediari metabolici sau precursori au urmatorii: sarcozina si betaina, proveniti prin N-metilarea (mono si respectiv trimetilarea) glicinei; b-alanina care intra in constitutia unor dipeptide (carnozina si anserina), a acidului pantotenic si a coenzimei A; acidul g-aminobutiric cu rol de transmisie a influxului nervos; ornitina si citrulina care se gasesc in special in ficat si iau parte la circuitul urogenetic, fiind intermediari in sinteza argininei; homoserina si homocisteina,intermediari in metabolismul unor aminoacizi; acidul D-glutamic izolat din peretele celular al bacteriilor; D-alanina in larvele sau crisalidele anumitor insecte; D-serina din unii viermi.O varietate mare de aminoacizi ale caror functii metabolice nu sunt definite inca, se gasesc in ciuperci si plantele superioare; unii dintre acestia,cum sunt canavanina,acidul djencolic si b-cianoalanina sunt toxici pentru alte vietuitoare

3. Aminoacizii esentiali

Cei 20 de aminoacizi naturali constituie alfabetul proteinelor. Distributia lor calitativa si cantitativa intr-o proteina determina caracteristicile chimice, valoarea ei nutritiva si functiileei metabolice in organism. Dintre cei 20 de aminoacizi uzuali, organismul uman si al vertebratelor superioare poate sintetiza un numar limitat, restul trebuie sa fie furnizati zilnic prin hrana si se numesc aminoacizi esentiali

Cei mai multi autori, considera drept aminoacizi esentiali urmatorii: valina, fenilalanina, metionina, lisina, triptofanul; altii, includ si leucina, izoleucina, treonina si histidina.

4. Nomenclatura:

In general, pentru aminoacizi se folosesc denumiri uzuale precum si prescurtarile acestora, acceptate de IUPAC, care nu dau nici o indicatie asupra structurii. In paralel se folosesc si denumirile stiintifice care respecta logica secventiala: acid, pozitia gruparii -NH2, prefixul amino urmat de numele acidului carboxilic.

Tabelul nr. 1

Aminoacizii uzuali

Tabelul nr. 2

Aminoacizi neproteinogeni

5. Caracteristici generale :

Aminoacizii indeplinesc mai multe roluri biologice, fiind in acelasi timp:

ioni dipolari cu un moment de dipol mare, care determina o crestere considerabila a mediului in care se dizolva;

electroliti amfoteri solubili in apa, cu capacitatea de a actiona ca substante tampon in diferite domenii de pH;

sunt optic activi, datorita faptului ca poseda unul sau mai multi atomi de carbon asimetrici, cu exceptia glicinei;

sunt compusi cu grupe reactive capabile sa participe la reactii chimice avand ca rezultat o mare gama de produse sintetice;

sunt liganzi ai multor metale;

sunt participanti in reactii metabolice cruciale, de care depinde viata si sunt substante in vitro pentru o gama mare de enzime;

sunt constituenti esentiali ai moleculelor proteice ale caror caractere specifice,biologice si chimice sunt determinate in mare parte de numarul, distributia si interrelatiile aminoacizilor din care se compun.

Ei prezinta unitate si diversitate in acelasi timp:

unitate, deoarece sunt a-aminoacizi cu toate consecintele fizice care decurg din aceasta si pentru ca cei care sunt componenti uzuali ai proteinelor au aceeasi configuratie optica a atomului de carbon din pozitia a

diversitate, deoarece fiecare din ei poseda o catena diferita, care-i confera proprietati unice, deosebindu-l fizic,chimic si biologic de ceilalti.

6. Proprietati fizice

Toti aminoacizii sunt substante solide, incolore, cristalizate. Forma cristalelor este caracteristica pentru fiecare aminoacid. Se topesc la temperaturi ridicate (peste 200 C), cu descompunere; nu pot fi distilate nici chiar in vid. Pt. al cristalelor nu constituie un criteriu de diferentiere intre ei.

Aminoacizii sunt, in general, solubili in apa, insa gradul de solubilitate este diferit de la un aminoacid la altul. Solubilitatea este determinata de caracterul mai mult sau mai putin polar al catenei si de pH, fiind minima la punctul izoelectric. Sunt in general insolubili in solventi organici, cu exceptia prolinei, care este relativ solubila in etanol.Solubilitatea aminoacizilor ca si cea a proteinelor, este influentata de prezenta sarurilor.

Termenii inferiori din seria aminoacizilor alifatici au gust dulceag,cei cu masa moleculara mare au gust amar.

Tabelul nr.3

Proprietati fizice ale aminoacizilor

7. Stereochimia aminoacizilor

Toti aminoacizii proteinogeni (cu exceptia glicocolului) au un atom de carbon asimetric si deci pot exista sub forma a doi antipozi optici. Treonina si izoleucina au doi centri asimetrici si deci au patru stereoizomeri.

Prin sinteza chimica se obtin in general formele racemice. Scindarea acestora nu poate fi efectuata prin metoda chimica obisnuita, cu ajutorul bazelor si acizilor optic activi, fiindca aminoacizii sunt acizi, respectiv baze prea slabe pentru a forma saruri stabile, cristalizabile cu acesti compusi. Singurul aminoacid suficient de puternic pentru a putea fi scindat prin intermediul sarii sale cu chinina, este acidul glutamic. Restul aminoacizilor se transforma intai in derivati acilati,care blocheaza gruparea amino si permite reactia cu baze optic active. Mai avantajoase s-au dovedit metodele biochimice pentru scindarea racemicilor, folosind marea specificitate a enzimelor pentru stereoizomerii naturali.

Activitatea optica este exprimata cantitativ prin rotatia specifica [a] D, la temperatura de 20 sau 25, iar D fiind lungimea de unda - de obicei linia D a sodiului, 589.3 nm. Activitatea optica depinde de natura solventului, iar in cazul solutiilor apoase, de pH. In general, rotatia optica specifica a unui aminoacid monoaminic sau monocarboxilic este maxima la punctul izoelectric. Rotatia specifica depinde de natura catenei aminoacidului.

S -a stabilit ca toti aminoacizii din proteinele naturale se inrudesc cu L-glicerinaldehida,si deci fac parte din seria L.In peretele celular al unor microorganisme sau in unele antibiotice se gasesc si aminoacizi din seria D.(In notatia moderna, literele D si L se inlocuiesc cu R, respectiv S)

COOH COOH

H-C-NH2 H2N-C-H

R R

D-aminoacid L-aminoacid

8. Proprietati spectrale

Aminoacizii uzuali nu absorb lumina in vizibil. Dintre acestia, numai tirosina,fenilalanina si triptofanul dau spectre de absorbtie la lungimi de unda mai mari de 250nm,datorita nucleului aromatic din catena.Fenilalanina prezinta un maxim de absorbtie la 260nm,tirosina la 275nm si triptofanul la 280nm.Intrucat majoritatea proteinelor contin tirosina, masurarea absorbtiei luminii la 280nm la spectrofotometru poate constitui o metoda satisfacatoare de dozare a concentratiei proteinei intr-o solutie.Cistina absoarbe la 240nm,datorita gruparii -S-S-. Toti aminoacizii absorb in U.V. indepartat.

Datorita comportarii diferite in solutie a aminoacizilor,in functie de conditii,spectrele IR difera sin ele in functie de conditiile experimentale.

In spectrul RMN, protonul a din aminoacizi are o deplasare chimica (d) cuprinsa intre 4.30 si 4.80 ppm./1,7,9/.

9. Proprietati electrochimice

Datorita prezentei in molecula atat a unei grupari functionale acide (-COOH),cat si a uneia bazice (-NH2), aminoacizii sunt substante cu caracter amfoter.Atat in cristale cat si in solutie apoasa,moleculele lor apar sub forma de ioni dipolari (amfioni). Dovada acestui fapt s-a facut prin difractia razelor X, determinarea constantelor de bazicitate si aciditate, a momentelor dielectrice, precum si pe baza interpretarii spectrelor Raman.Structura care reprezinta caracterul lor dipolar rezulta prin reactia protolitica intramoleculara:

R-CH-COOH R-CH-COO-

NH2 +NH3

In prezenta acizilor sau bazelor, solutiile aminoacizilor functioneaza ca solutii tampon.Daca se adauga solutiei de aminoacid un acid tare (HCl), protonii sai sunt consumati, dand un acid slab:

R-CH-COO- + H3O+ R-CH-COOH + H2O

+NH3 +NH3

In prezenta unei baze tari, ionii HO- sunt consumati, formandu-se o baza slaba:

R-CH-COO- + HO- R-CH-COO- + H2O

+NH3 +NH2

Amfionul dipolar nu migreaza in camp electric;in mediu acid insa, aminoacidul se afla sub forma de cation si va migra catre anod, iar in mediu bazic se afla sub forma de anion si va migra catre catod. Toti aminoacizii pot fi neutri in solutie, deoarece gruparile amino si carboxil se neutralizeaza reciproc;predomina forma amfionica a carei concentratie maxima este conditionata de o anumita valoare a pH-ului, numita punct izoelectric,notat pHi.Punctul izoelectric este pH-ul la care solutia apoasa contine anioni si cationi ai aminoacidului in proportie egala:

pHi (pK1 pK2)/2

Valoarea punctului izoelectric depinde de valoarea constantelor de ionizare: K1 pentru functiunea carboxil si K2 pentru functiunea amina;pK1 si pK2 se determina titrimetric.

Pentru aminoacizii monoamino-monocarboxilici pHi se gaseste situat in domeniul de pH= 4.8-6.3, deoarece grupa -COOH este mai puternic ionizata decat gruparea -NH2, variatiile fiind determinate de efectul exercitat de radicalul R de la Ca asupra celor doua functiuni,amino si carboxil.

Aminoacizii monoamino-dicarboxilici au pHi situat la valori mai mici ale pH-ului (domeniu acid) ca o consecinta a faptului ca in molecula exista inca o grupare carboxil,care nu participa la salifierea interna si pentru a nu fi disociata este firesc ca valoarea pH-ului solutiei sa se gaseasca situata in domeniul acid.

Aminoacizii diaamino-monocarboxilici, din aceleasi considerente,au puncte izoelectrice situate la valori mari ale pH-ului,respectiv in domeniul bazic.

La punctul izoelectric solubilitatea aminoacidului respectiv este minima, deoarece momentul de dipol mare al amfionului duce la o puternica atractie intre moleculele din cristal.Aceasta proprietate prezinta importanta pentru separarea unor aminoacizi din amestecuri.

Pe baza celor mentionate, se poate explica si comportarea solutiilor de aminoacizi la trecerea unui curent electric,conductibilitatea acestora fiind determinata de valorile pH-ului.

Din punct de vedere structural,sub aspect functional, electronic si steric, a-aminoacizii se prezinta ca specii moleculare cu caracteristici bine determinate.

10. Proprietati chimice

Prezenta grupelor amino si carboxil confera aminoacizilor caracter acid si caracter bazic,precum si capacitatea de a da reactiile generale caracteristice acizilor carboxilici si aminelor, tinand seama totodata si de efectele reciproce pe care le exercita aceste grupari.

Aminoacizii dau cu ionii cuprici si ai altor metale tranzitionale saruri complexe interne sau chelati, colorati,greu solubili,stabili.Acestia au structuri ciclice fara tensiune, in care aminoacidul ocupa doua pozitii coordinative ale metalului,una prin oxigen, alta prin perechea de electroni neparticipanti ai grupei amino, de tipul:

COO NH2-CH-R

Cu

R-CH-NH2 OOC

a. Proprietati determinate de gruparea carboxil

Aminoacizii formeaza derivati normali ai acestei functiuni: esteri, amide,anhidride,nitrili,cloruri acide etc.

Clorurile acide (obtinute prin tratare cu PCl5) ale aminoacizilor suspendati in clorura de acetil se obtin numai sub forma de clorhidrati si sunt foarte reactive.Derivatii N-acilati ai aminoacizilor ,in aceleasi conditii, formeaza si ei cloruri acide care elimina insa HCl si dau azlactone:

R-CH-COOH R-CH-COCl R-CH-C=O

NH-COR' NH-COR' N=C-R'

Esterii se obtin sub forma de cristalohidrati, prin tratare directa cu metanol sau etanol saturati cu acid clorhidric gazos.Esterii aminoacizilor inferiori se pot distila la presiune redusa.Ei au caracter bazic, dat de gruparea -NH2, gruparea -COOH fiind blocata. La conservare sau la incalzire, esterii aminoacizilor se transforma in polipeptide si in 2,5-dicetopiperazine-1,4-disubstituite:

O

C

R-CH NH

HN CH-R

C

O

Esterii se pot reduce prin hidrogenare catalitica sau cu sodiu si alcool, cu hidrura de litiu si aluminiu, cu borohidrura de sodiu etc,dand a-aminoalcooli:

H2N-CH-COOR' H2 H2N-CH-CH2-OH

R R

Esterificarea cu etanol sau alcool benzilic este adesea utilizata pentru a proteja gruparea carboxil in cursul sintezei chimice a peptidelor.

Sub actiunea amoniacului sau a aminelor, aminoacizii si esterii lor dau nastere la aminoamide H2N-CHR-CONH2.

Atunci cand gruparea -COOH reactioneaza cu gruparea -NH2 din alta molecula de aminoacid se obtine o legatura amidica de tip special, legatura peptidica:

H2N-CHR-COOH + H2N-CHR'-COOH H2N-CHR-CO-NH-CHR'-COOH + H2O

Pot reactiona mai multe molecule de aminoacid in acest fel, obtinandu-se un lant sau o catena polipeptidica.Compusii cu numar mare de resturi de aminoacizi sunt proteine.Aceasta proprietate de a se combina intre ei dand nastere polipeptidelor si proteinelor este una din cele mai importante caracteristici ale aminoacizilor.

b. Proprietati determinate de gruparea -NH2

Functiunea -NH2 din aminoacizi poate lua parte la alte tipuri de reactii.Astfel, prin tratare cu cloruri acide sau anhidride, se obtin derivati acilati.Acest procedeu se foloseste de obicei pentru a proteja functiunea aminica in timpul sintezei chimice a peptidelor:

C6H5-COCl + R-CH-COOH R-CH-COOH + HCl

NH2 NH-CO-C6H5

( R=H- acid hipuric)

Se mai pot folosi sulfoclorurile aromatice, cloroformiatii de alchil, in special cei de t-butil, sau chiar acidul formic.Derivatul benziloxicarboxilic Ph-CH2-O-CO-NH-CHR-COOH , corespunzator aminoacidului (numit si derivat carbobenzoxi ) sau t-butiloxicarbonilic (t-BOC-derivatul) Me3C-OOC-NH-CHR-COOH, sunt cei mai comuni derivati protejati ai a-aminoacizilor. Cand prepararea lor se efectueaza in conditii suficient de blande, configuratia atomului de carbon este conservata, dar in conditii mai energice are loc o racemizare.

Prin acilare, grupa -NH2 pierde caracterul ei bazic, iar aminoacizii acilati, de tipul acidului hipuric, sunt acizi de taria acizilor carboxilici obisnuiti.In prezenta hidroxizilor, aminoacizii se combina cu CO2, dand derivati ai acidului carbonic.

R-CH-COOH + CO2 + Ba( OH)2 R-CH-COO- Ba2+

NH2 NH-COO-

Reactiile de acest tip au loc probabil in cazul transportului dioxidului de carbon de catre hemoglobina.Aminoacizii se pot alchila la grupa -NH2 prin metodele uzuale (cu iodura sau sulfat de metil in prezenta unui hidroxid alcalin). Derivatii metilati cuaternari ai aminoacizilor sunt denumiti betaine. Reprezentantul cel mai cunoscut, betaina, este derivatul trimetilic al glicinei si se obtine din acid cloracetic si trimetilamina:

HOOC-CH2Cl + N(CH3)3 HOOC-CH2-N(CH3)3]+Cl- -HCl -OOC-CH2-N+(CH3)3

Betaina este mult raspandita in plante, de exemplu in sfecla (Beta vulgaris), acumulandu-se in melasa in timpul extractiei si purificarii zaharului.Se gaseste si in muschii multor nevertebrate.Betainele, fiind saruri cuaternare de amoniu, sufera prin incalzire transpozitie de tip degradare Hofmann;reactia este reversibila.

(CH3)3N+-CHR-COO- (CH3)2N-CHR-COOCH3

O reactie mult folosita a aminoacizilor este cea cu bromura de nitrozil sau cu acid azotos in solutie

acida, obtinandu-se hidroxiacizii corespunzatori si degajandu-se azot : H2N-CHR-COOH HONO HO-CHR-COOH + N2 + H2O

Aceasta reactie se foloseste in chimia analitica pentru dozarea cantitativa a gruparii libere -NH2 din aminoacizi si proteine, masurand volumul de azot degajat ( metoda Van Slyke).

In solutie de HCl sau HBr se formeaza prin aceasta reactie acizii clorurati sau bromurati respectivi.

Esterii a-aminoacizilor dau cu acid azotos diazoesteri:

EtOOC-CH2-NH2 + HNO2 EtOOC-CHN2 + 2H2O

ester diazoacetic

Prin tratamente termice, aminoacizii se descompun, dand diferiti compusi, in functie de pozitia gruparii -NH2 fata de -COOH. Astfel a-aminoacizii dau 2,5-dicetopiperazine; b-aminoacizii duc la acizi nesaturati prin eliminare de NH3:

H2N-CHR-CH2-COOH R-CH CH-COOH + NH3

g si d-aminoacizii elimina usor apa intramolecular dand lactame

R-CH-CH2-CH2-COOH R-CH-CH2-CH2 + H2O

NH2 NH CO

Prin distilare uscata, in prezenta hidroxidului de bariu ori sub actiunea enzimelor de putrefactie, aminoacizii se decarboxileaza, conducand la amine:

H2N-CHR-COOH R-CH2-NH2 + CO2

Multe dintre acestea sunt substante cu proprietati fiziologice si farmacologice remarcabile (amine biogene)

HOOC-(CH2)3-NH2 CH2-CH2-NH2 H2N-(CH2)5-NH2

Acid g-aminobutiric OH etanolamina cadaverina

N C-CH2-CH2-NH2 CH2-CH2-NH2

CH CH SH

NH histamina cisteamina

Prin topire cu hidroxidul de potasiu, aminoacizii sufera descompuneri adanci, ducand la acizi grasi si amoniac sau amine.

Cu anumiti agenti oxidanti,aminoacizii sufera degradari,dand aldehidele imediat inferioare sau nitrilii corespunzatori

R-CHO + NH3 + CO2

R-CH-COOH

NH2 R-CN + H2O + CO2

O reactie caracteristica a aminoacizilor este cea cu ninhidrina (hidratul tricetohidrindenului).Se formeaza compusi colorati in albastru cu majoritatea a-aminoacizilor; exceptie fac prolina si hidroxiprolina care formeaza compusi galbeni.In prima faza se produce o degradaere oxidativa a aminoacizilor la aldehide.

Prin condensarea cetoalcoolului cu o noua molecula de ninhidrina si cu amoniac se formeaza produsul colorat.Una din structurile posibile ale acestuia este urmatoarea.

Reactia cu ninhidrina are o mare importanta in chimia analitica, servind la recunoasterea si dozarea aminoacizilor

11. Transformari biochimice

Transformarile pe care le sufera a-aminoacizii in organismele vii sunt reactii catalizate de enzime specifice.Biochimia aminoacizilor include toate transformarile chimice pe care le sufera a-aminoacizii in organismele vii.Analiza acestor transformari evidentiaza faptul ca in ele sunt implicate direct grupele functionale amino si carboxil si chiar radicalul pe care sunt grefate aceste grupari.

Grupa amino poate fi eliminata din moleculele a-aminoacizilor, formandu-se in final amoniac, care la randul sau este supus altor transformari biochimice, conducand la uree sau acid uric care se elimina din organism.

Dezaminarea poate fi: oxidativa, hidrolitica sau reductiva, enzimele respective fiind, in functie de tipul de reactie, o oxidaza, hidrolaza si respectiv reductaza.

ox R-C-COOH H2O R-C-COOH + NH3

NH O

R-CH-COOH dezaminare hidr. R-CH-COOH + NH3

NH2 OH

red. R-CH2-COOH + NH3

a-ceto, a-hidroxi si respectiv acidul organic, care se formeaza in urma dezaminarii, devin in organism o sursa de formare a glucidelor sau grasimilor /2,3,5,7,8/.

Pierderea CO2 in prezenta unor enzime specifice fiecarui aminoacid conduce la formarea de amine biogene.

R-CH-COOH R-CH2-NH2 + CO2

NH2

Dezaminarea si decarboxilarea prin reactii enzimatice pot avea loc si simultan sub influenta unor microorganisme.Astfel se explica,de exemplu,prezenta alcoolului izoamilic, a alcoolului amilic optic activ si a alcoolului izobutilic in 'coada' de distilare care se obtine la fabricarea alcoolului etilic /1,2,5,8,9,11/.

a-cetoacizii si a-aminoacizii prezenti in organism, pot participa la reactii, in urma carora prin mai multe etape, acizii a-cetonici se transforma in a-aminoacizi si invers.

Enzimele care catalizeaza reactiile de transaminare se numesc transaminaze.In organismele vii poate fi sintetizat orice a-aminoaci daca este prezent acidul a-cetonic corespunzator /1,2,3,7,12/.

Acidul glutamic joaca un rol important in reactiile de transaminare, fiind donorul de grupa

-NH2, iar pe de alta parte acidul a-cetoglutaric este capabil sa accepte grupa -NH2 de la aproape toti

L-aminoacizii naturali, tramsformandu-se in acid glutamic:

HOOC-(CH2)2-CH-COOH + CH3-C-COOH HOOC-(CH2)2-C-COOH +

NH2 O O

CH3-CH-COOH

NH2

Transformarile catalizate de enzime, care au loc in cursul transferului grupei amino fara formare de amoniac, de la acidul L-glutamic la acidul piruvic, sunt complexe.Acidul L-glutamic, la randul sau, poate reface acidul a-ceto glutaric si prin desaminare oxidativa.

Organismul animal nu-si poate sintetiza unii a-aminoacizi ( aminoacizii esentiali) datorita faptului ca nu poseda a-cetoacizii corespunzatori.

In prezenta unor microorganisme au loc si degradari mai profunde, scindari de legaturi carbon-carbon, concomitente cu reactii de oxidare, esterificare s.a. explicandu-se, astfel, diversitatea de compusi organici identificati in organism sau compusi care se elimina.

12. Identificarea si dozarea aminoacizilor

Se realizeaza prin mai multe metode si anume:

1. Reactii de culoare: cea mai importanta este reactia a-aminoacizilor cu ninhidrina.Compusii de culoare albastra au un maxim de absorbtie la 570nm.Prolina si hidroxiprolina dau cu ninhidrina compusi galbeni cu maxim de absorbtie la 440nm.Adaosul de compusi de cadmiu stabilizeaza culoarea.

2. Masurarea absorbtiei in u.v. se poate folosi pentru dozarea aminoacizilor aromatici, in amestec cu alti aminoacizi.Citirea se face la 260nm pentru fenilalanina si 280nm pentru tirosina si triptofan.

3. Metode cromatografice.Se folosesc toate variantele acestei tehnici:CH,CSS,CSI,GC,HPLC.

In cromatografia pe hartie (CH) si in strat subtire (CSS) exista o stransa dependenta intre constitutia catenei unui aminoacid si viteza sa de migrare.Cei cu catene hidrofobe mari (valina, leucina, izoleucina, fenilalanina, tirosina, triptofanul, metionina) migreaza mai repede decat cei cu catene hidrofobe mai scurte (alanina, glicina, prolina) si decat cei cu catene hidrofile (cisteina, serina, treonina, acid aspartic, acid glutamic, lisina, arginina, histidina). Migrarea diferentiata a aminoacizilor este determinata de afinitatea mai mare pe care o au aminoacizii cu catene hidrofile pentru faza stationara (apoasa) si cei cu catene hidrofobe pentru faza mobila (solvent organic). In cazul amestecurilor complexe de aminoacizi se foloseste cromatografia bidimensionala, folosindu-se un amestec de solventi organici cu migrare intr-un sens si un alt amestec de solventi pentru sensul perpendicular pe primul. Aminoacizii se dozeza prin tratare cu o solutie de ninhidrina, la cald, elutia fiecarui spot colorat intr-un solvent al compusului cu ninhidrina, stabilizarea acestuia prin combinatii cu saruri de cadmiu si citirea absorbtiei la o lungime de unda de 570nm la un spectrofotometru.

Separarea cromatografica pe schimbatori de ioni are loc datorita afinitatii diferite a aminoacizilor pentru acestia, in functie de constantele de disociere a gruparilor -COOH si NH2. Elutia aminoacizilor retinuti in coloana se face cu solventi cu valori de pH crescande (in gradient de pH); elutia aminoacizilor se va face in ordinea inversa afinitatii lor pentru schimbatorul de ioni folosit.S-au elaborat doua tehnici: una folosind un colector automat de fractiuni si a doua, folosind un analizor automat de aminoacizi.

In cazul cromatografiei de difuzie pe gel, aminoacizii cu molecula mai mica si mai hidrofili difuzeaza in gel si sunt mai puternic retinuti;cei cu molecule mai mari raman in apa dintre particulele de gel si ies mai repede de pe coloana.

In electroforeza sau ionoforeza, separarea are loc sub actiunea unui camp electric. Aminoacizii se separa in functie de valoarea constantei lor de disociere la un anumit pH dat. Se foloseste de obicei pH-ul 4,0 la care separarea este neta pentru toti aminoacizii (in conditiile unei tensiuni electrice mari, 70 V/cm).

Indiferent de metoda de separare,prelucrarea probelor cu ninhidrina si citirea absorbtiei la 570nm este procedura finala comuna.

Pentru dozari exacte, in special pentru stabilirea unor mecanisme de reactie sau a unor cai de metabolizare sau de biosinteza se aplica metoda dilutiei izotopice /1,3,5,8,9/.

Prezenta unor anumiti aminoacizi este indicata dupa pozitia maximelor, iar raportul in care se gasesc,dupa intensitatea maximelor de absorbtie:

Asp:Thr:Ser:Glu:Pro:Gly:Ala

4. Determinari microbiologice

Exista doua tipuri de metode microbiologice folosite la dozarea aminoacizilor. Prima metoda se bazeaua pe compararea gradului de dezvoltare a unui microorganism dependent de aminoacidul ce urmeaza sa fie dozat, cu o curba de dezvoltare prestabilita in functie de concentratia aminoacidului. A doua metoda de dozare microbiologica se bazeaza pe faptul ca unele microorganisme contin enzime specifice de degradare pentru anumiti aminoacizi, de exemplu decarboxilaze care catalizeaza decarboxilarea aminoacidului cu degajare de CO2. Se masoara cantitatea de CO2 degajata in conditii de lucrubine stabilite, care este proportionala cu concentratia aminoacidului in proba.

13. Metode de preparare

Importanta deosebita a aminoacizilor atat pentru cercetarile biochimice, nutritionale si microbiologice, cat si pentru utilizarea lor in preparate farmaceutice, alimente si furaje a determinat elaborarea unei multitudini de metode de preparare in laborator si in industrie. Astfel, aminoacizii pot fi obtinuti prin izolarea lor din hidrolizatele acide,bazice sau enzimatice ale proteinelor, prin sinteze chimice si prin biosinteza.

I. Izolarea din hidrolizatele proteice

Izolarea aminoacizilor se poate realiza folosind adsorbtia pe carbune activ, pamanturi adsorbante, schimbatori de ioni, cromatografie de repartitie, electroforeza,coprecipitare cu reactivi specifici.In timpul hidrolizei acide, triptofanul este degradat aproape complet; el se separa din hidrolizatele alcaline.Serina si treonina sunt si ele distruse partial in conditiile hidrolizei acide.De asemenea, in timpul hidrolizei acide si alcaline, aminoacizii se racemizeaza partial.Prin hidroliza enzimatica se obtin aminoacizi optic activi, cu configuratiaL.Izolarea din hidrolizatele proteice serveste la prepararea industriala a multor aminoacizi, cum sunt:acidul glutamic,lisina,cisteina,arginina,triptofanul,tirosina.

II. Sinteze chimice de aminoacizi

1. Aminarea acizilor a-halogenati

Prin tratarea unui acid a-clorurat sau a-bromurat cu amoniac sau hexametilentetramina se obtine aminoacidul corespunzator:

R-CH-COOH + 2NH3 R-CH-COOH + NH4X

X NH2

Metoda se aplica la toti a-bromacizii accesibili prin bromurarea acizilor, folosind metoda Hell-Volhard-Zelinski.Se utilizeaza un exces mare de amoniac, pentru evitarea formarii de amine secundare si tertiare.Cu HMTA se formeaza un aduct care se descompune prin incalzire cu HCl, dand aminoacidul cu randament mare.

2. Aminarea reductiva

Prin reducerea catalitica (cu Pd si H2) a unui a-cetoacid in prezenta amoniacului se obtine aminoacidul corespunzator:

R-C-COOH +NH3 R-C-COOH +H2 R-CH-COOH

O -H2o NH NH2

a-cetoacidul sau esterul acetilacetic substituit pot fi transformati in oxime, hidrazone sau fenilhidrazone, care formeaza aminoacidul respectiv, prin reducere chimica sau catalitica:

R-CO-COOH +PhNHNH2 C6H5-NH-N-CR-COOH H2 H2N-CHR-COOH

CH3-CO-CHR-COOEt HON CR-COOEt H2N-CHR-COOH

Reducerea se poate efectua cu Sn si HCl sau Zn si CH3-COOH, cu amalgam de sodiu sau de Al, catalitic (cu Ni Raney) sau electrolitic.

Importanta preparativa a metodei reductive este mult marita prin obtinerea compusilor azotati intermediari pe cai mai simple decat cele de la acizii a-cetonici.O astfel de cale este cuplarea esterilor b-cetonici a-substituiti cu saruri de diazoniu aromatice (Feofilaktov, 1938).

R-CH-COOEt + C6H5-N N]+Cl- R-C-COOEt R-CH(NH2)-COOH +

COCH3 N-NHC6H5

+H2N-C6H5

3. Aminarea prin transpozitie intramoleculara

Aceasta metoda implica transformarea unui derivat al acidului cianoacetic intr-o azida sau amida si apoi in aminoacidul dorit, folosind transpozitiile (degradarile) Schmidt, Curtius sau Hofmann:

CN CN CN CN COOH

R-CH R-CH R-CH R-CH R-CH

COOEt CONHNH2 CON3 NHCOOEt NH2

CN CONH2 NH2

R-CH R-CH R-CH

COOH COOH COOH

4. Reactia cianhidrina (sinteza Strecker, 1858)

Aceasta metoda implica interactiunea unei aldehide cu ionul cianura, in prezenta amoniacului sau a carbonatului de amoniu.Se formeaza aminonitrilul,respectiv hidantoina substituita, care prin hidroliza cu acizi sau baze, se transforma in aminoacidul respectiv:

R-CH O + HCN R-CH-CN R-CH-CN R-CH-COOH

OH NH2 NH2

+(NH4)2CO3

R-CH-CO-NH +H2O

NH-CO -NH3, -CO2

5. Condensarea cu esteri N-acilati ai acidului aminomalonic

Esterul aminomalonic se obtine prin reducerea esterului izonitrozomalonic.Derivatii N-acilati formeaza combinatii sodate, care reactioneaza in acelasi mod ca esterul malonic sodat.Se utilizeaza de obicei derivatul N-acetilat sau N-formilat.

EtOOC EtOOC EtOOC

CH2 ONOH C NOH +H2, -H2O CH-NH2 Ac2O

EtOOC EtOOC EtOOC

EtOOC

CH-NH-COCH3

EtOOC

Se pot folosi si esteri aminocianoacetici N-acilati:

EtOOC-CH-NH-COCH3

CN

Derivatii esterilor acidului aminomalonic se transforma in combinatii sodate (cu etoxid de sodiu) care, prin condensare cu halogenuri de alchil sau acil si hidroliza ulterioara, formeaza aminoacizii corespunzatori.

EtOOC R-X EtOOC H2O HOOC-CH-R

C-Na+ -NaX CR -CO2 NH2

EtOOC NHAc EtOOC NHAc -AcOH

NC NC

C-Na+ + RX -NaX CR H2O

EtOOC NHAc EtOOC NHAc -CO2,-NH3,-AcOH

6. Condensarea unei aldehide cu un compus avand o grupa metilen activ

Aceasta metoda se foloseste pentru obtinerea aminoacizilor aromatici sau heterociclici si se realizeaza pornind de la o aldehida aromatica, care se condenseaza cu o azlactona (de exemplu 2,5 dicetopiperazina, hidantoina, rodanina sau 2-mercaptotiazolin-5-ona).Dupa reducere cu amalgam de sodiu sau zinc si acid acetic si hidroliza se obtine aminoacidul corespunzator.Aceasta metoda este o aplicare a condensarii Perkin.

NH

O H2C-CO H2C-CO H2C-CO

O  NH NH S

NH HN-CO S-CS HN-CS

2,5 dicetopiperazina hidantoina rodanina 2-mercaptotiazolin-5-ona

H2C-CO Ar-CH O

Ar-CH O + N O H2O N O H2

Ph Ph

azlactona

Ar-CH2 O H2O Ar-CH2-CH-COOH

N O -PhCOOH NH2

Ph

7. Oxidarea aminoalcoolilor

Metoda este limitata la aminoalcoolii accesibili.

AcHN-CHR-CH2OH + [O] AcHN-CHR-COOH + H2O

8. Se cunosc o serie de metode chimice de sinteza specifice unor aminoacizi, deci cu aplicabilitate limitata; de exemplu, aditia amoniacului la dubla legatura a acizilor nesaturati:

HOOC-CH CH-COOH + NH3 HOOC-CH2-CH-COOH

acid fumaric NH2 acid asparagic

III. Obtinerea formelor optic active

Metodele chimice de sinteza conduc de obicei la aminoacizi racemici.Dedublarea formelor racemice ale aminoacizilor se poate realiza, in principiu, prin urmatoarele metode :

Cristalizarea selectiva a unuia din enantiomeri din solutia saturata a acestuia.

Formarea de saruri diastereoizomere cu baze sau acizi chirali. Se folosesc de obicei aminoacizi N-acilati, pentru a le intensifica caracterul acid si a forma saruri cu baze optic active.

Se pot utiliza si esteri ai aminoacizilor, care au caracter bazic mai pronuntat decat aminoacizii si formeaza saruri cu acizi optic activi. Aminoacizii bazici reactioneaza ca atare cu acizii optic activi (acid D-camforic). Sarurile diastereoizomere se separa prin diferenta de solubilitate. Dupa separare, prin hidroliza se obtin aminoacizi liberi.

c.) Tratarea racemicului cu preparate enzimatice.Aceasta metoda este inalt selectiva datorita marii specificitati a enzimelor si poseda avantajul ca permite obtinerea unor izomeri cu coufiguratie cunoscuta. Procedeele constau in:

- introducerea amestecului racemic, prin ingerare (furaj) sau prin injectare, intr-un animal, ale carui enzime metabolizeaza numai forma L.Din urina se separa apoi enantiomerul D ramas netransformat;

- oxidarea sau decarboxilarea cu ajutorul unor microorganisme specifice sau tesuturi, ale unuia din izomeri, celalalt ramanand neatacat.

- hidroliza asimetrica sub actiunea unor enzime (amidaze, esteraze, acilaze) ale derivatilor aminoacizilor racemici substituiti in mod adecvat, prin care se elibereaza numai antipodul L, care se separa de enantiomerul D ramas nehidrolizat.

IV. Metode de biosinteza a aminoacizilor

Aceste metode se bazeaza pe capacitatea de biosinteza a microorganismelor si au avantajul ca se obtin aminoacizi din seria L, avand configuratia aminoacizilor naturali din proteine. Mecanisme foarte precise de reglare mentin concentratia aminoacizilor in celule in limite foarte stranse. Prin mutageneza, celulele microbiene sufera modificari genetice, cu implicatii asupra mecanismelor de reglare. Ele pot suferi o mutatie sau deletie a genelor operatoare sau reglatoare ale unora din enzime sau prin mutasie genetica se pot codifica enzime modificate astfel incat sa nu mai fie sensibile la metabolitul care le regleaza in mod normal. Acest fel de microorganisme cu mecanismele de reglare modificate, cu permeabilitatea membranei celulare schimbata sau cu deficiente metabolice, pot fi intrebuintate industrial pentru producerea unor metaboliti importanti pentru om, printre care si aminoacizii.

Pentru obtinerea aminoacizilor se folosesc mutanti de Brevibacterium sau Corymbacterium, dependenti de alti aminoacizi ce fac parte din schema de biosinteza a aminoacidului in cauza (de exemplu pentru producerea lisinei se folosesc mutanti dependenti de homoserina) sau mutanti rezistenti la analogi ai respectivului aminoacid.

Drept materii prime se folosesc hidrati de carbon, alcooli,hidrocarburi alifatice cu cel putin 10 atomi de carbon, compusi cu azot (proteine, peptide, uree, saruri de amoniu), saruri minerale (ce contin K, Mg, Ca, P, Fe, Mn, Zn etc) si factori de crestere. Aceste substante sunt folosite de microorganisme pentru a se dezvolta si pentru a efectua biosinteza propriu-zisa a aminoacidului.

In timpul biosintezei se introduce aer sub presiune, steril, care furnizeaza oxigen diferitelor procese metabolice. In functie de aminoacid, concentratia acestuia in mediile fermentate este cuprinsa intre cateva grame si pana la 90-100 g/l. Aminoacizii astfel sintetizati sunt izolati si purificati cu ajutorul schimbatorilor de ioni, cristalizarii fractionate, adsorbtiei pe diferiti adsorbanti.

V. Metode mixte

Aceste metode se folosesc de avatajele metodelor chimice si biochimice,deopotriva. Astfel, se produc in cantitati mari intermediari prin sinteza chimica si apoi sunt supusi transformarilor stereospecifice, cu obtinerea directa a L-aminoacidului.

14. Utilizarile aminoacizilor

Aminoacizii se folosesc in medicina pentru prepararea unor medicamente si pentru alimentatia artificiala in anumite imbolnaviri ale sistemului digestiv, in caz de interventii chirurgicale etc. Se folosesc in alimentatie, pentru suplimentarea unor produse deficitare in aminoacizi esentiali, pentru accentuarea aromelor, pentru prepararea supelor concentrate, a alimentelor pentru copii, alimentatia dietetica pentru cosmonauti, ca antioxidanti la prepararea conservelor si bauturilor etc.

Cantitati mari de aminoacizi se folosesc in zootehnie, pentru obtinerea concentratelor furajere si pentru a mari digestibilitatea furajelor bogate in hidrati de carbon si sarace in proteine complete. Se folosesc, de asemenea, pentru prepararea unor medii bacteriologice necesare depistarii unor boli.

Aminoacizii esentiali indeplinesc functii diferite in organism.

Din punct de vedere fiziologic aminoacizii au un rol deosebit.

Acidul glutamic are un rol major in dezintoxicarea organismului, glutamina obtinuta prin aminarea lui fiind recomandata impotriva oboselii, depresiei si impotentei.

Glicina intervine in sinteza hemoglobinei; ca precursor al glutationului, glicina se combina cu acidul colic si formeaza glucocolati (saruri biliare) cu rol deosebit in digestie. Serina participa la sinteza cefalinei si stingomielinei.

Arginina trece in ornitina care permite sinteza spermidinei si sperminei, prolamine considerate principali factori de crestere.

Tirosina este precursorul a doi hormoni tiroidieni si anume: triiodotironina si tiroxina. De aceea, tirosina este deosebit de importanta in eliminarea dereglajelor tiroidiene. De remarcat ca tirosina este precursor al adrenalinei si noradrenalinei, substante cu rolimportant in pastrarea echilibrului psihic.

Valina. Insuficienta ei in ratia alimentara provoaca:

scaderea consumului de hrana,

dereglari de coordonare a miscarilor,

hipertensiune si moartea sobolanilor supusi experientei.

Lizina intra in componenta triptofanului si metioninei. Insuficienta de lizina in ratia alimentara are drept consecinta:

dereglarea circulatiei sanguine,

micsorarea numarului de eritrocite in sange si continutului de hemoglobina,

provoaca istovirea muschilor,

dereglari in calcificarea oaselor,

diverse modificari patologice in ficat si plamani.

Insuficienta lizinei la oameni provoaca:

cefalee,

vertijuri,

greata,

voma,

anemie,

leucopenie.

Includerea lizinei in ratia alimentara face sa sporeasca numarul de reticulocite in maduva oaselor. Sunt sarace in lizina cerealele. Sursele principale de lizina le constituie branza de vaci, carnea, pestele.

Leucina contribuie la normalizarea bilantului de azot, a metabolismului proteic si glucidic. In insuficienta de leucina:

se incetineste cresterea,

se micsoreaza masa corpului,

apar modificari in ficat, in glanda tiroida.

Izoleucina intra in componenta proteinelor organismului. Lipsa izoleucinei in ratia alimentara provoaca echilibru azotat negativ.

Metionina este donatorul principal de grupe metilice labile, folosite la sinteza colinei (substanta cu insusiri biologice active, cu actiune lipotropa). Metionina normalizeaza metabolismul lipidelor si al fosfolipidelor in ficat si se recomanda la profilaxia si tratarea aterosclerozei. Acidul folic stimuleaza eliminarea grupelor metilice ale metioninei, asigura sinteza colinei in organism. Metionina este necesara la functionarea suprarenalelor si la sinteza adrenalinei. Sursa principala de metionina este branza de vaci.

Treonina. In lipsa ei la animale se retine cresterea, se micsoreaza masa corpului, provocand chiar moartea lor.

Triptofanul participa la sinteza albuminei si globulinei. Este necesar la cresterea animalelor si mentinerea echilibrului azotat, la sinteza proteinelor serice si a hemoglobinei, a acidului nicotinic si joaca un rol important in profilaxia pelagrei. Triptofanul conduce la formarea serotoninei care este un vasoconstrictor puternic, un bun stimulator al contractiei muschilor netezi, un excelent neurotransmitator al sistemului nervos central.

Surse importante de triptofan sunt carnea, pestele, branza de vaci, ouale. Sunt bogate in triptofan soia, fasolea, mazarea. O cantitate relativ mica de triptofan contine proteina porumbului. Din aceasta cauza ratia alimentara cu utilizarea preponderent' a porumbului poate provoca pelagra.

Fenilalanina participa la normalizarea functiei glandei tiroide ssi a suprarenalelor. Din fenilalanina se sintetizeaza tirozina care contribuie la formarea adrenalinei.

Histidina participa la sinteza hemoglobinei. Decarboxilarea histidinei contribuie la formarea histaminei, care dilata vasele, mareste permeabilitatea peretilor lor.

Proteinele alimentare, reiesind din valoarea lor biochimica, se impart in 3 categorii:

I - proteinele din ou, carne, lapte, peste. Ele contin toti aminoacizii esentiali in proportii optime pentru sinteza proteinelor organismului si mentin echilibrul proteic in organism;

II - proteinele din legume uscate, cereale. Acestea contin toti aminoacizii esentiali, dar nu in proportii suficiente pentru sinteza proteinelor omului;

III - gelatina din oase, tendoane, cartilagii, zeina din porumb. in structura proteinelor porumbului lipsesc mai multi aminoacizi, si cei prezentisunt in raporturi dezechilibrate si au valoarea biologica scazuta. Valoarea lor biologica poate fi marita prin asocierea cu proteine de calitate superioara. De exemplu: mamaliga cu lapte sau branza.

Lipsa proteinelor in alimentatie duce la:

stari de denutritie cronica,

diferite boli (hepatoza, pelagra s.a.),

istovirea celulelor nervoase,

retinerea cresterii la copii,

micsorarea sintezei hormonilor suprarenalelor, hipofizei, tiroidei, pancreasului, glandelor sexuale,

micsorarea masei corpului,

anemie,

leucopenie,

polihipovitaminoza,

deregliri ale metabolismului mineral (osteoporoza);

pielea devine uscata, unghiile - fragile, cade parul.

Este daunator pentru organism si surplusul de proteine. Excesul lor in ratia alimentara se soldeaza cu:

supraincarcarea organismului cu produsele metabolismului proteic,

cu intensificarea proceselor de putrefactie in intestine,

cu supraincarcarea ficatului si rinichilor.