GENERALITATI ASUPRA ENZIMELOR

GENERALITATI ASUPRA ENZIMELOR

Enzimele definite drept componente de natura proteica, produse de celulele vii care catalizeaza reactii de sinteza si degradare din organismele animale, vegetale si microorganisme, prezinta numeroase implicatii si aplicatii in industria alimentara. Fiind componente ale materiilor prime vegetale si animale utilizate in industria alimentara, a caror activitate nu inceteaza odata cu recoltarea, depozitarea, conservarea si prelucrarea tehnologica a acestora, enzimele pot manifesta actiuni favorabile, dorite, care conduc la imbunatatirea calitatilor naturale constitutionale, gustative etc. sau nefavorabile si nedorite, determinind degradarea si pierderea valorilor nutritive. Daca in acest sens se are in vedere activitatea enzimelor proprii materiilor prime vegetale si animale, enzimele ca atare sub forma de preparate enzimatice, obtinute din diferite surse bogate in enzime, isi gasesc multiple aplicatii ca adaosuri, fiind folosite inca din cele mai vechi timpuri ca de exemplu cheagul la prepararea brinzeturilor, "Koji' (kabi-taki = "floare de mucegai', preparat enzimatic obtinut prin cultivarea lui Aspergillus oryzae pe un decoct de orez sau alte cereale), la prepararea unor produse traditionale-fermentate, larg raspindite in Asia de Sud-Est.

In ultimele decenii, preparatele enzimatice si-au gasit numeroase utilizari in diferite sectoare ale industriei alimentare. Aceasta crestere spectaculoasa a gradului de utilizare a preparatelor enzimatice in industria alimentara (dar si nealimentara) este explicata prin eficienta si precizia, versatilitatea si economicitatea cu care actioneaza aceste preparate enzimatice.

Se postuleaza existenta in materia vie a circa 10 000 de enzime diferite, dintre care circa

2 000 au fost izolate, in stare mai putin sau mai mult purificata si a caror interventie si actiune in diferitele procese metabolice este mai mult sau mai putin cunoscuta. Catalizind reactiile biochimice din organismele vegetale si animale, enzimele conditioneaza desfasurarea, coordonarea si autoreglarea acestor reactii prin care se realizeaza procesele metabolice (anabolice si catabolice) ale cresterii, dezvoltarii, reproducerii si tuturor activitatilor celulare.

In industria alimentara, prelucratoare de materii prime vegetale si animale, practic nu exista procese tehnologice in care sa nu fie implicate enzimele endogene, proprii materiilor biologice folosite sau ale microorganismelor utilizate in prelucrarea acestora; in plus, in multe cazuri, in prezent, se recurge la suplimentarea acestor activitati enzimatice cu enzime exogene, cu preparate enzimatice obtinute din diverse surse bogate in enzime, tesuturi vegetale, animale si mai ales in ultimii ani din culturile diverselor microorganisme.

Indiferent ca se au in vedere enzimele endogene, proprii materiilor prime sau cele adaugate acestora, ele se caracterizeaza prin urmatoarele proprietati generale:

- sunt cei mai eficienti catalizatori cunoscuti astazi; in concentratii extrem de mici ( 10^-6 M sau chiar si 10^-9 M) determina realizarea reactiilor cu viteze extrem de mari;

- reactiile catalizate enzimatic se produc in conditii compatibile cu viata, la temperatura si presiune obisnuita, in mediu slab acid, neutru sau slab alcalin ;

- manifesta specificitate de actiune (determina producerea unui anumit tip de reactii, de exemplu de oxidoreducere, de hidroliza, de sinteza etc.) si de substrat (recunoaste numai un anumit reactant, sau un grup limitat de reactanti);

- asigura coordonarea, reglarea si controlul proceselor biochimice la care participa si care stau la baza metabolismului celular.

Constitutia enzimelor

Determinanta pentru functia catalitica a enzimelor este configuratia lor, respectiv structura si organizarea spatiala a moleculei proteice care manifesta activitatea enzimatica.

Din punct de vedere structural, enzimele se impart in doua categorii:

- enzime de natura exclusiv proteica, constituite in intregime din proteine (de exemplu: pepsina, tripsina, papaina etc.) ;

enzime de natura heteroproteica formate dintr-o parte proteica (apo-enzima) si una neproteica denumita cofactor enzimatic. Cele doua parti separate sint inactive catalitic; impreuna formeaza complexul molecular apo-enzima:cofactor, respectiv holoenzima care manifesta activitate catalitica.

In structura holoenzimei, cofactorul imprima specificitate de actiune, respectiv tipul si viteza de reactie catalitica, in timp ce apoenzima imprima specificitatea de substrat, deci determina substanta asupra careia actioneaza enzima.

Apoenzima, fiind de natura proteica, va manifesta proprietatile generale ale proteinelor:

este termolabila si nedializabila;

stabileste legatura enzimei cu substratul;

manifesta grade diferite de afinitate pentru cofactor;

este susceptibila de modificari conformationale in anumite limite.

Cofactorul enzimatic reprezinta componente neproteice, de natura chimica foarte diferita, care sunt indispensabile pentru manifestarile activitatii catalitice a numeroase enzime.

Dupa natura chimica si modul lor de legare la apoenzima, cofactorii se clasifica:

coenzima;

grupari prostetice;

ioni metalici.

Coenzimele sunt compusi organici, derivati din vitamine, care se ataseaza temporar la apoenzima si care sunt usor disociabili de acestea. Ele trec usor de la o apoenzima la alta, putand sa participe la transformarea altor molecule de substrat dupa terminarea unei anumite reactii. Din ei fac parte: NAD⁺, NADP⁺, FMN, FAD, ATP, CTP, acidul lipoic etc.

Gruparile prostetice sunt substante organice fixate pe apoenzima, care disociaza greu, deoarece sunt legate prin legaturi covalente. Aceste grupari sunt: TPP, piridoxalfosfatul, hemul. Gruparea prostetica imprima mecanismul unor procese enzimatice: transportul de electroni, de grupari -NH₂, acetic etc.

Ionii metalici sunt indispensabili pentru exercitarea functiei catalitice a unor enzime, participand in calitate de cofactori sau de componente structurale ale acestora. Ele se mai numesc metal-enzime, iar printre ionii care indeplinesc rol de cofactor se pot mentiona: Mg²⁺, Mn²⁺, Cu²⁺, Zn²⁺, Fe²⁺, Fe³⁺, Mo²⁺. Unele enzime pot contine chiar doi ioni metalici.

Exercitarea proprietatilor catalitice ale enzimelor se realizeaza prin intermediul situsurilor catalitice - centrilor sau zonelor active - care reprezinta ansamblul gruparilor chimice din structura enzimei ce participa efectiv in manifestarea activitatii enzimatice (de exemplu, anumite resturi din aminoacizii constituenti ai lanturilor polipeptidice si cofactorii enzimatici, care vin in contact direct cu substratul).

In functie de organizarea lor structurala se disting: enzime monomerice, constituite dintr-un lant polipeptidic care nu poate fi disociat in subunitati fara pierderea activitatii lor catalitice si enzime oligomerice care sunt agregate moleculare constituite din doi sau mai multi protomeri, respectiv lanturi polipeptidice similare sau diferite, care prin disociere sau din contra prin asociere devin catalitic-active. Pentru o serie de enzime s-au stabilit existenta unor forme moleculare multiple sau izoenzime, care catalizeaza realizarea aceleiasi reactii biochimice, dar care difera intre ele prin configuratii spatiale diferite (compozitie in aminoacizi constituenti), prin proprietatile lor fizico-chimice (pH sau temperatura optima, cinetica de reactie, comportare fata de inhibitori sau activatori etc.). imunologice etc.

Se cunosc, de asemenea, asa-numitele sisteme sau complexe multienzimatice constituite din enzime intim legate prin interactiuni necovalente, care participa la realizarea unor secvente de reactii biochimice consecutive si inlantuite, in care produsul de reactie al primei enzime devine substrat pentru cea de a doua enzima, al carui produs de reactie devine substrat pentru a treia enzima etc., pina la realizarea intregului sir de reactii prin care se metabolizeaza in celule un component biochimic. Astfel de sisteme sau complexe multi-enzimatice sunt, in general, localizate in celule la nivelul diferitelor formatiuni sau organite subcelulare.

Cinetica reactiilor si factorii care influenteaza activitatea enzimelor

Enzimele catalizeaza producerea reactiilor chimice, termodinamic posibile, fara schimbarea echilibrului de reactie, prin scaderea energiei de reactie a reactantilor si prin cresterea vitezei de reactie a reactantilor (in vivo ele conditioneaza desfasurarea, coordonarea si autoreglarea reactiilor biochimice ale materiei vii, prin care se realizeaza procesele metabolice ale cresterii, dezvoltarii, reproducerii si tuturor activitatilor celulare).

Intr-o reactie catalizata enzimatic, enzima (E) formeaza cu substratul (S) un complex intermediar de tranzitie (ES) foarte reactiv si instabil, care se transforma rapid, conducind la eliberarea produsului sau produsilor de reactie (P) si a enzimei ce poate relua reactia, dupa schema generala:

E + S ES EP P + E

O serie de enzime catalizeaza reactii in care pot interactiona doua sau chiar mai multe substraturi. Asa, de exemplu, sunt transferazele care catalizeaza transferul unei grupari chimice functionale de pe un substrat (donor) pe alt substrat (acceptor), realizindu-se reactii de simpla sau dubla deplasare.

Mecanismul catalizei enzimatice, sub raportul interactiunii dintre enzima si substrat, al formarii complexului reactiv enzima - substrat si transformarea acestuia in produsi de reactie, se bazeaza pe diferite interpretari, explicindu-se prin ipotezele "broasca-cheie', potrivirii induse, catalizei covalente si catalizei generale prin acizi si baze.

Viteza reactiilor catalizate enzimatic este dependenta de: concentratia enzimei si a substratului, afinitatea enzimei fata de substrat, temperatura, pH, efectori (activatori sau inhibitori), potential redox, radiatii etc.

In anumite limite, viteza reactiilor catalizate enzimatic este direct proportionala cu concentratia enzimei, pentru ca, la concentratii crescute ale enzimei, sa devina aproape constanta. Cresterea concentratiei substratului determina initial o crestere rapida a vitezei de reactie, pentru ca ulterior viteza de reactie sa creasca lent, iar la concentratii mari de substrat sa devina maxima, capatand o valoare constanta (fig. 1). Expresia matematica care defineste relatia dintre viteza de reactie catalizata enzimatic si concentratia substratului este data de ecuatia Michaelis-Menten :

v_max*[S]

V = ----- ----- -------

K_M+[S]

in care: v- este viteza de reactie la un moment dat;

v_max - viteza maxima de reactie, corespunzatoare concentratiei mari de substrat, cind enzima este saturata cu substrat ;

[S] -concentratia substratului ;

k_M - constanta Michaelis-Menten, moli/1.

Din punct de vedere grafic, ecuatia Michaelis-Menten reprezinta o hiperbola, indicind o tranzitie de la o faza in care viteza de reactie este dependenta de concentratia substratului (faza in care reactia este de ordinul 1) la o faza independenta de concentratia substratului (faza in care reactia este de ordinul zero), in care viteza de reactie devine maxima, enzima fiind saturata cu substrat. La o viteza egala cu 1/2 din viteza maxima corespunde o valoare determinata a concentratiei substratului denumita k_M sau constanta Michaelis-Menten, care se exprima in moli/1 si care indica afinitatea enzimei fata de substrat; cu cit k_M are o valoare mai mica, cu atit afinitatea enzimei pentru substrat este mai mare si invers, cu cit k_M are o valoare mai mare cu atit afinitatea enzimei pentru substrat va fi mai mica.

In anumite limite (pina la circa 60 80C), viteza reactiilor enzimatice creste o data cu temperatura (temperatura la care viteza de reactie este maxima corespunde temperaturii optime de actiune a enzimei). La temperaturi mai mari decit temperatura optima, viteza de reactie scade rapid, avind loc un proces de denaturare termica a enzimei (fig. 2). Temperatura optima a enzimelor este influentata si conditionata de structura chimica a enzimei, a substratului, si de concentratia acestora in sistemul de reactie. In general, activitatea enzimelor scade la temperaturi peste 50 60C; totusi exista enzime care isi pastreaza inca in mare masura activitatea si la temperaturi de peste 60C, ca de exemplu: papaina, o proteaza vegetala activa la 80C; peroxidaza din hrean care ramine activa si dupa o incalzire la 100C.

Activitatea enzimelor este dependenta de pH-ul mediului in care isi exercita actiunea. pH-ul la care activitatea este maxima este denumit pH optim al enzimei, iar pH-ul la care enzima isi mentine activitatea in cele mai bune conditiuni se numeste pH optim de stabilitate. Cele doua pH-uri optime ale unei enzime, de activitate si de stabilitate, pot avea valori apropiate, pot sa coincida sau pot sa fie diferite (fig. 3).

Activitatea enzimelor este, de asemenea, influentata de prezenta unor efectori (diferite substante chimice) in mediul de exercitare a activitatii lor; activatorii influenteaza pozitiv, iar inhibitorii negativ activitatea enzimelor. In functie de natura si modul de actiune al inhibitorilor, inhibitia enzimatica este de mai multe tipuri: ireversibila, reversibila (competitiva si necompetitiva), si alosterica.

Clasificarea enzimelor

Recenta clasificare si nomenclatura a enzimelor se bazeaza pe principiile si regulile stabilite si publicate in anul 1964, revizuite si republicate in 1973 de Comisia de Enzime a Uniunii Internationale de Biochimie (I.U.B.) si a Uniunii Internationale de Chimie Pura si Aplicata (I.U.P.A.C.). In acest sens, enzimele au fost clasificate in 6 clase (numeroase subclase si sub-subclase) si anume:

- oxidoreductaze - catalizeaza reactiile de oxidoreducere prin transfer de hidrogen sau electroni, sau prin combinarea unui substrat cu oxigenul molecular ;

- transferaze - catalizeaza transferul diferitelor grupari chimice de la un substrat donator la un alt substrat acceptor;

- hidrolaze- catalizeaza scindarea hidrolitica a diferitelor substraturi, prin aditia apei la nivelul diferitelor grupari chimice;

- liaze - catalizeaza aditia sau indepartarea unor grupari chimice din substraturi, prin mecanisme diferite fata de hidroliza;

- izomeraze-catalizeaza rearanjari intramoleculare ;

- ligaze sau sintetaze - catalizeaza sinteza unor noi legaturi prin unirea a doi compusi intr-unul singur, folosind ca sursa energetica nucleozidtrifosfatii.

Clasele de enzime se impart in subclase si sub-subclase, in functie de o serie de detalii privind gruparile supuse transformarii si natura cofactorilor implicati in reactia catalizata enzimatic.

Pentru nomenclatura enzimelor se folosesc nume uzuale sau traditionale, care sint de obicei formate din numele substratului asupra caruia actioneaza enzima, urmat de terminatia -aza si nume sistemice (recomandate de Comisia de Enzime) formate din numele substratului sau substraturilor si tipul de reactie catalizat, urmat de terminatia aza, insotite de un cod (alcatuit din patru cifre care reprezinta clasa, subclasa, sub-subclasa si numarul de ordine), precedat de EC (Enzyme Commission). Citeva exemple, privind numele unor enzime importante pentru industria alimentara:

E.C. 3.2.1.2 α-1-4-Glucan maltohidrolaza ( β-amilaza)

E.C. 3.1.1.3. Glicerol ester hidrolaza (lipaza)

Unitati de masura ale activitatii enzimelor

In principiu, determinarea activitatii enzimelor se efectueaza prin : masurarea gradului de transformare a substratului, masurarea concentratiei produsului de reactie sau masurarea cineticii de reactie, urmarite intr-un anumit interval de timp prin metode fizice sau chimice adecvate. Activitatea enzimelor se exprima cantitativ in unitatile propuse de Comisia de Enzime (CE) si anume:

- Unitatea de activitate enzimatica (U) reprezinta cantitatea de enzima care catalizeaza transformarea a l mmol substrat/min in conditii standard (25C, pH si concentratie de substrat optime). Aceasta unitate de masura recomandata de CE in 1961 se foloseste inca in prezent; CE recomanda renuntarea sau abandonarea progresiva a folosirii unitatii U si trecerea la Kat.

- Katalul (Kat) reprezinta cantitatea de enzima care catalizeaza transferarea a l mmol substrat/s in conditii standard. (Prin definitie aceasta unitate de masura se apropie mai mult de dimensiunile constantelor de viteza folosite in cinetica chimica respectiv mol/s.) Se foloseste si multiplul kilokatal (K Kat) si respectiv submultiplii milikatul (mKat), microkatul (mKat), nanokatul (nKat) si picokatul (pKat).

- Activitatea specifica - reprezinta numarul de unitati enzimatice/mg proteina (respectiv Kat/kg proteina si mKat/kg proteina).

- Activitatea enzimatica molara (numar de transfer = turnover number) - reprezinta numarul de molecule de substrat transformate de catre o molecula de enzima in timp de l min sau l s (Kat/mol enzima).

Cu toate aceste recomandari ale Comisiei de Enzime, in lucrari mai vechi sau chiar si in prezent se folosesc si alte moduri, arbitrare, de exprimare a activitatii enzimelor, care de obicei sint definite de cei ce le utilizeaza.