AMPRENTA GENETICA IN PRACTICA MEDICO-LEGALA

AMPRENTA GENETICA IN PRACTICA MEDICO-LEGALA

Istoria justitiei este presarata de descoperiri stiintifice care constituie tot atatia pasi in sensul unor probe dorite a fi de nerespins, indiferent de obiectivele propuse. Cercetarea stiintifica este strabatuta de dezbateri, marcate rareori de crize privind raporturile dintre stiinta si om, intre cercetarea constanta si legitima asupra securitatii necesare exercitiului libertatii si riscul permanent de a submina aceste libertati.

Ca si amprentele digitale la inceputul secolului si amprenta genetica, apare azi ca aducand un aport crucial in serviciul politiei, justitiei si adevarului. Dar mai mult decat amprentele digitale, amprentele genetice sunt in centrul conflictelor dintre nevoile noastre fundamentale.

in 1944 Oswald Avery a stabilit rolul componentei celulare cunoscute sub denumirea DNA (dezoxiribonucleic acid) - ADN (acidul dezoxiribonucleic) - in romana ca vehicolul transmiterii caracterelor ereditare. in 1953 James Watson si Francis Crick au elucidat structura moleculei de ADN sub forma dublei spirale.

in stiinta, ca si in arta, forma urmeaza functiei, intrucat adevarata explicatie a proprietatilor sale unice, presupune capacitatea de a se transmite cu exactitate din generatie in generatie. in 1980 David Botstein si colaboratorii au fost primii care au exploatat micile variatii gasite intre oameni la nivel genetic, ca repere pentru constructia unei harte a genomului uman. Tipul particular al variatiei, pe care ei au utilizat-o, a fost denumita 'Restriction Fragment Lenghth Polymorphism' (RFLP- polimorfismul de talie).

in 1984, in timp ce studia markerii bolilor in ADN, Alee Jeffreys a descoperit unica aplicabilitate a tehnologiei RFLP in identificarea persoanei. Metoda sa, denumita amprenta ADN', a fost modificata si adoptata de catre laboratoarele politiei criminale si generalizata astazi in lume. Oamenii de stiinta accepta azi ca fiind mai descriptiv si mai complet termenul de profil ADN sau profilul ADN. in 1986 termenul de 'polymerase chain reactin' (PCR - reactia polimerazica inplant) a fost inventat de Kary Mullis care a si primit o parte a premiului Nobel in chimie pentru descoperirea sa. PCR, mai mult decat orice alt progres stiintific, in afara poate de elucidarea structurii ADN a schimbat fata biologiei moleculare. Astfel tehnologia RFLP si PCR impreuna formeaza piatra de temelie a profilului ADN.

Trebuie de notat faptul ca analiza ADN, in general are o mult mai larga arie de utilizare si un mai lung istoric, decat exacta identificare a probelor provenind de la locul faptei. Asa cum s-a mentionat mai sus, o aplicatie initiala si continua este cercetarea genelor implicate in boli. in mare parte, gratie eforturilor depuse in proiectul deslusirii genomului uman, toate informatiile continute in codul genetic uman au inceput si continua a fi descifrate si catalogate. Astfel se ajunge la identificarea genelor implicate in boli ca cea a lui Huntington, a fibrozei chistice, distrofiilor musculare si variatele influente genetice in cancer. O aplicatie specifica consta in monitorizarea transplantului de maduva osoasa la bolnavii de leucemie. Aceste aplicabilitati ale profilului ADN sunt mai rapide si mai putin inclinate spre eroare, ca orice alta metoda de tipare a sangelui. Cand sangele bolnavului corespunde caracterului de histocompatibilitate ale donorilor, transplantul este posibil. Mai mult pentru stabilirea diagnosticului si a medicatiei se folosesc probe clinice de inlocuire a generior in unele din aceste boli.

Cercetarea filiatiei este printre primele domenii in care profilul ADN a fost folosita. Cercetarea paternitatii, care se rezolva pana acum numai prin expertiza serologica, incepe a se indrepta catre testul ADN.

Resturile biologice spre exemplu pot, de asemenea, fi identificate prin profilul ADN, si putand fi uneori folosite si dupa moarte in determinarea probabilitatii sau a unei stranse relatii genetice cu cei in viata. Copiii abandonati ar putea reveni la adevaratii parinti aplicand testul ADN. Tot prin acest test, laboratoarele de identifeiare ale fortelor armate americane au identificat resturile umane a 15 veterani ai razboiului din Vietnam la cei 20 ani dupa moartea acestora.

Afost initiat recent un program de rutina pentru colectarea de probe de la toti membrii fortelor armate americane. Resturi din corpul uman pot folosi la identificare in cazul catastrofelor de tot felul, cum ar fi cazul de la Balotesti.

Exemplele de identificare prin testul ADN incep sa fie din ce in ce mai numeroase in cazuri foarte complicate, ramase fara raspuns pana acum. Unul din cazurile cele mai des citate de aplicare a testului ADN este cel prin care in Marea Britanie a fost identificat Colin Pitchfork ca responsabil pentru moartea a doua fete, dupa ce initial, pe baza aceluiasi test, a fost acuzat un inocent. Noutatea acestui caz consta in faptul ca fiecare barbat intre 13 si 34 ani (aproape 4000) domiciliati in trei sate apropiate au fost chemati sa dea spre analiza probe de sange, ceea ce a dus la descoperirea adevaratului autor.

in Statele Unite atat FBI cat si companii private acreditate, utilizeaza testul ADN in medicina judiciara. Astfel, de la introducerea testului in anul 1986 in SUAel a fost folosit in peste 24.000 de cazuri. Este de remarcat ca mai mult de 1/3 din suspectii de viol au fost eliberati, fiind exclusi prin testul ADN. Excluderea unui suspect prin testul ADN este absoluta, nefiind in nici un caz vorba de o probabilitate statistica. in SUA se continua aplicarea testului la cei acuzati pe baza unor probe incerte, iar rezultatele obtinute nu au putut fi contestate din punct de vedere stiintific.

Asadar, testul ADN permite astazi de a se gasi semnatura crimei in codul genetic al autorului.

Privit intr-o maniera generala, aplicabilitatea testului ADN se refera la 4 domenii importante:

1. Identificarea suspectilor;

2. Descoperirea crimelor sau delictelor;

3. Cercetarea paternitatii;

4. Idenficiarea victimelor catastrofelor.

Este important de subliniat ca utilizarea ADN in practica judiciara desi constituie un element probant al anchetei, nu trebuie sa i se substituie ci s-o intareasca. Introducerea acestei probe, necesita neaparat o modificare a practicii anchetatorilor pe teren, cum ar fi tehnicile de prelevare a probelor, absenta ideilor preconcepute, etc, ceea ce de fapt semnifica o noua organizare a anchetei.

Merita subliniat insa faptul ca in numeroase tari acest mare progres al stiintei nu este insotit de clarificari pe plan juridic; unul dintre pericole ar fi practicarea testului fara stirea persoanei. Astfel se pune problema consimtamantului in virtutea principiului inviolabilitatii persoanei, aspect nereglementat inca legal. Apoi, o data prelevate, ce devin esantioanele? Cum sa te pui la adapost de o utilizare necontrolata? lata tot atatea probleme care-si asteapta inca un raspuns.

Aplicatiile stiintei in arena justitiei este fundamental una de reconstructie adica incercarea de a ajuta in a se stabili ce s-a intamplat, cand s-a intamplat, unde s-a intamplat si cine este implicat Citandu-I pe Conan Doyle care spunea 'cand niciodata nu ai exclus imposibilul, ramane ceva care desi improbabil, poate fi adevarat', intelegem de ce atunci cand stiinta este aplicata in acest domeniu este obligatoriu implicata medicina legala, chemata astfel sa ajute justitia in stabilirea atat in penal, cat si in civil a unor elemente concrete biofizice. Legea defineste elementele infractiunii; stiinta contribuie prin informatii in a determina daca un element exista sau nu.

in medicina judiciara si criminalistica exista doua principale concepte prin care se fac asocierile dintre probleme: acestea sunt cunoscute sub denumirile de 'identificare' si 'individualizare'.

Un subiect este identificat atunci cand el poate fi distins dintr-un grup de subiecti avand caracteristici similare. Un subiect insa poate fi individualizat numai atunci cand descrierea lui difera de orice alt subiect existent in lume. Individualizarea rezida deci in cunoasterea unor caractere foarte rare si care, binecunoscute si controlate prin studii populationale, permit diferentierea de alti subiecti cu caractere similare.

Stiinta medico-legala si criminalistica au clasificat un numar de probleme cu care s-au confruntat in mod obisnuit in investigatiile criminale si a dezvoltand teste bazate pe acele caracteristici care s-au dovedit utile in identificare, precum si probleme care apartin unei anumite categorii de situatii. Spre exemplu, parul este in mod obisnuit gasit in cazul unor crime si acte de violenta. Analistii au gasit ca examinand anumite caracteristici microscopice, il vom putea identifica fie drept par fie ca o fibra oarecare, caractere care de asemenea pot servi in a-l plasa in categoria parului uman si nu animal.

Un element cheie ce trebuie luat in seama atunci cand determinam daca o caracteristica apartine unei categorii sau este o caracteristica individuala, este originea acelei caracteristici. Acele caracteristici descrise in cadrul unui proces controlat devin caracteristicile unei categorii. Exemplul include specificitatea ghinturilor unei arme, caracteristicile urmei unui obiect de incaltaminte, cocaina din planta, sau grupa sanguina a unei persoane. Primele doua exemple rezulta din procesul repetitiv al fabricarii, in timp ce urmatoarele doua exemple sunt produse biologice sub control genetic. Asadar, cand obiecte sau substante sunt produsul unui proces repetitiv supus controlului, rezulta caracteristicile unei anumite categorii. Caracteristicile uneianumite categorii pot sa cuprinda milioane de subiecte identice sau numai doua.

Trasaturile individuale sunt cele create de procese intamplatoare si prin aceasta neprevizibile si necontrolabile. Amprentele digitale sunt rezultatul unui proces intamplator ce are loc intr-un anumit moment al gestatiei. Datorita numarului diferitelor combinatii posibile de trasaturi sau combinatii spatiale ale degetului, se accepta ca nu exista doua amprente digitale identice.

Valoarea unei metode de identificare rezida in abilitatea expertului de a compara urmele lasate la locul faptei cu cele gasite pe alte materiale. Daca urmele sunt gasite similare, atunci sunt individualizate caracteristicile net diferite dintre cele doua urme.

Referindu-ne la amprentele digitale este de notat ca, intrucat toata lumea s-a obisnuit cu ideea ca ele reprezinta caracteristici individuale s-a extrapolat aceasta notiune si la ADN cu toate ca in fond denumirea este inadecvata. Metoda amprentei genetice dezvoltata de Alee Jeffreys examineaza mai multe locusuri ale ADN dintr-un genom o singura data; rezultatul a fost modele de benzi a caror complexitate a sugerat amprenta digitala si ea este probabil specifica si unica pentru fiecare individ. Din cauza complexitatii sistemului totusi s-a decis ca examinarea, unui singur profil genetic sa permita obtinerea unui rezultat mai usor de inteles si arata mai bine printr-o apreciere numerica semnificatia modelelor genetice similare. Aceasta metoda numita profilul ADN este de asemenea mai adecvata examinarii unor probe amestecate, si de atunci un numar de 1-2 benzi obtinute de la o persoana devin concludente.

ADN-ul poate fi izolat gratie tehnicilor chimice simple. Aceasta etapa poate deveni foarte delicata in criminalistica datorita calitatii probelor prelevate, conservarii acestora si suportului pe care ele se gasesc.

ADN poate fi extras in cadrul unei spete judiciare fie din:

- sange prelevat pe anticoagulant;

- urme de sange gasite la locul faptei;

- celule epiteliale (bucale, vaginale) sau sperma prelevate pe tampon sau din pete;

- celule ale radacinii parului sau chiar din par;

- celule osoase;

- celule ale pulpei dentare.

S-a stabilit cu exactitate cantitatea de ADN continuta in fiecare prelevat. De asemenea, se stie astazi ca sunt necesare aproximativ 100 celule pentru a putea realiza o amprenta genetica.

in cazul parului fara bulb sau a oaselor vechi este preferabil sa fie studiat ADN-ul mitocondrial, caci el exista intr-un mai mare numar de copii dar el este exclusiv de origine materna.

Valoarea prelevarilor de la locul faptei pentru cercetarea ADN depinde de pregatirea expertilor, tinand seama ca:

- orice proba prelevata poate fi pierduta;

- orice proba defectuos prelevata poate fi contaminata.

Evident ca principala limita a analizei ADN este absenta prelevarilor. Prin urmare, in toate tarile se insista asupra unei pregatiri adecvate a personalului insarcinat cu prelevarea probelor de la locul faptei in vederea analizei ADN si in multe tari unor astfel de specialisti li se elibereaza chiar o diploma dupa un examen de specialitate.

Este de notat ca aceasta formare profesionala trebuie sa fie continuata, dat fiind evolutia rapida a metodelor de prelevare corespunzatoare diferitelor probe. Precautiile ce se iau sunt extrem de stricte. Astfel, scena crimei este inconjurata de un cordon prin care nu se poate trece. in acest perimetru nu patrunde decat personalul specializat si cativa reprezentanti ai aparatului de justitie avand haine de protectie si insotiti de persoane calificate. Criminalistii, ei insisi, vor avea haine de protectie speciale, caschete, manusi si masca, (manusile se schimba dupa fiecare proba prelevata). Aceste masuri se inscriu pe linia grijii permanente de a nu polua zona contaminata inclusiv necontaminarea virala.

Atunci cand tehnicianul expert ajunge la locul faptei, nu trebuie sa aiba idei preconcepute, sa fie ermetic oricarui comentariu, sa preleveze nediscriminatoriu sau prioritar orice urma din zona sau de pe persoanele care sunt sau au trecut prin zona, sa observe atat urmele vizibile cat si cele invizibile, sa nu accepte dupa aparente originea urmelor (spre exemplu o pata rosie nu trebuie neaparat catalogata drept sange etc). Cercetarea locului faptei reclama multe ore de lucru.

Conservarea probelor prelevate este de asemenea esentiala. Urmele biologice vor trebui uscate, plasate in pungi speciale si conservate la rece. Aducerea probelor la laborator trebuie realizata in minimum de timp.

Se poate afirma ca succesul si calitatea unor analize biologice depinde de calitatea probelor prelevate, lucru binecunoscut in medicina legala. Referindu-ne la molecula de ADN trebuie spus ca ea este foarte stabila, rezistand spre exemplu la temperaturi extreme. Pentru a denatura molecula de ADN in dublu helix, adica a sparge legatura dintre bazele purinice si pnmidinice este necesara mentinerea la 100 grade celsius in vitro mai multe minute. Daca este lasata sa se raceasca lent cele doua lanturi complementare se reimperecheaza. Invers, ea rezista la temperaturi foarte joase. Este posibil sa fie extras ADN din insecte incastrate in chihlimbar, din mumii dar in general probele biologice obtinute de la locul crimei nu scapa de degradarea bacteriana, de actiunea razelor ultraviolete sau a anumitor substante chimice.

Este deci important ca anchetatorii, magistratii sau medicii legisti sa fie informati cu privire la masurile de precautie ce trebuie avute in vedere la locul infractiunilor. Spre exemplu, o pata de sperma pe un suport textil uscat si la adapost de lumina va putea furniza un profil genetic timp de cateva luni si chiar mai mult, in timp ce un prelevat vaginal pe tampon va trebui imediat refrigerat pentru a se evita degradarea rapida datorita prezentei florei miprobiene. Sangele va fi prelevat pe anticoagulant (EDTA) care va intarzia degradarea enzimatica. Celulele bucale si parul vor fi congelate.

Trebuie de notat totusi ca tehnicile de analiza a ADN-ului au devenit astazi de o asemenea sensibilitate, incat este necesara evitarea oricarei contaminari de catre un ADN uman strain. in cele ce umeaza vom prezenta o sinteza a tehnicilor folosite in cercetarea amprentei genetice in folosul justitiei.

1. GENERALITATI

Doar o mica parte din genom are continut informational (cunoscut) si deci codifica caractere ereditare, zone de ADN informational alternand cu zone non-informationale. Segmentele de ADN informational, care codifica o proteina specifica au 'atasate' segmente non-informationale (minisatelit ADN). in aceste segmente non-informationale se pot detecta multiple variatii individuale (fenomen numit polimorfism), variabilitatea fiind mai accentuata in anumite arii genomice, zone ce sunt denumite arii polimorfe.

Polimorfismele genetice intalnite in zonele non-informationale pot fi de mai multe tipuri:

- Polimorfism* de secventa (mutatii punctiforme); sunt determinate de inlocuirea unei singure baze azotate, lungimea segmentului corespunzator de ADN ramanand nemodificata. Identificarea polimorfismelor de secventa se efectueaza mai ales in locusul HLA DQ, folosindu-se sonde oligonucleotidice specifice pentru anumite alele, (exista patru variante majore: DQ1, DQ2, DQ3 si DQ4. Alelele DQ 1 si 4 au fiecare cateva variante: DQ1.1, DQ1.2, DQ1.3, DQ4.1, DQ4.2, DQ4.3).

- Pollmorfisme de lungime, care rezulta din insertia sau deletia a unei sau mai multor nucleotide care determina diferente de lungime a secventelor de ADN-non informational (RFLP).

- Polimorfisme de redundanta.

in zonele genomice hipervariabile intalnim blocuri alcatuite din fragmente de ADN-non informational, care se repeta identic, de un numar variabil de ori (4-40 repetitii), unul dupa altui. Acest bloc de repetitii tandemice ale unei secvente ADN ('core' sequence) formate din 11-60 perechi baze (pb), sunt numite VNTR (Variable Number of Tandem Repeats - Numar Variabil de

Tandemuri Repetate).

Exista o mare diversitate a VNTR atat din punct de vedere al structurii de baza cat si al numarului de repetari tandemice. Exista anumite VNTR cu o anumita structura care sunt distribuite in tot genomul (in aceeasi structura de baza, variind doar numarul de repetitii tandemice). Exista unele VNTR, care au o secventa unica, care se regasesc numai intr-un singur loc pe o singura pereche de cromozomi. in cazul acestora, pentru acelasi locus de pe un cromozom exista un locus corespunzator pe cromozomul omolog, blocurile VNTR fiind mostenite independent, transmise dupa legile Mendeliene, astfel incat pe o pereche de cromozomi omologi VNTR-ul provenit de la mama este diferit de VNTR-ul provenit de la tata, ceea ce permite nu numai identificarea individului dar si a parintilor sai (cele doua zone au identica secventa centrala si difera prin numarul de repetitii ale acesteia).

Rezulta ca atat compozitia secventei de baza cat si numarul de repetitii in cadrul VNTR dintr-un anumit locus genetic sunt comune tuturor celulelor unui individ, dar compozitia si numarul de repetari tandemice difera foarte mult intre locusuri hipervariabile VNTR situate pe cromozomi diferiti sau chiar in locusuri din cadrul aceluiasi cromozom, la acelasi individ.

Nu se cunoaste precis rolul acestor secvente repetitive, dar se banuieste ca ar servi ca semnal recombinant in cadrul geno-mului uman.

Dupa compozitia lor VNTR-urile pot forma familii bogate chimic in guanina, cum sunt marea majoritate a celor descoperite pana acum (astazi se cunosc circa 90 locusuri hipervariabile precum cel din compozitia insulinei, mioglobinei, -globinei, etc.j, sau bogate in adenina-timina (colagen tip III, apolipoproteina B, etc).

Tehnica profilului ADN (DNA profiling), profilul-tiparea- ADN (DNA typing) sau amprenta ADN (DNA fingerprinting) cum este popular cunoscuta isi propune analiza a mai multor locusuri hipervariabile din genomul uman pentru a obtine o 'amprenta' unica (sau aproape unica) pentru fiecare individ.

Pentru identificarea acestor regiuni hipervariabile se folosesc sonde ADN izotopice sau neizotopice: sonda multi-locus (Jeffreys, 1985) care cauta repetitiile tandemice ale unei secvente centrale prezente in mai multe locusuri diferite pe maimulti cromozomi diferiti si sondele mono-locus, care cauta repetitiile tandemice ale unei secvente unice precise care se gaseste numai intr-un singur locus, in cadrul unei singure perechi de cromozomi omologi.

in investigatia judiciara si medico-legala este utilizata astazi cu prioritate sonda mono-locus (acreditata de Lifecodes Corporation si implicit de FBI), datorita numeroaselor avantaje pe care aceasta tehnica le prezinta, dintre care rapiditatea (automatizare) si usurinta tehnicii sunt cele mai importante.

2. ETAPE ISTORICE IN CERCETAREA ADN-ULUI Sl A APLICATIILOR SALE MEDICO-LEGALE

-1869 Miescher descopera ADN (premiul Nobel in 1900);

-1944 Avery: ADN-ul poarta informatia genetica;

-1953 Watson-Crick descopera structura ADN (premiul Nobel)

-1957 Kornberg: ADN polimerazele;

-1961 Manum & Doty: renaturarea ADN;

- 1962Arber: nucleazeleADN;

-1962 Nathans & Smith: secventionarea ADN;

-1966 Nirenberg, Ochoa, Khorona: codul genetic;

-1967 Gellert: ligazeleADN;

-1970 Enzimele de restrictie

-1972-1973 Boyer, Cohen, Berg: donarea ADN;

-1975 Southern: hibridizarea;

-1975-1977 Sanger & Bonell si Maxam & Gilbert: secventializarea rapida a ADN;

-1980 Locusurile hipervariabile (VNTR);

-1980TehologiaRFLP;

-1985 Jeffreys: descopera posibilitatea utilizarii VNTR in identificare;

-1985 Mullis: tehnica PCR;

-1986 primul caz juridic rezolvat prin tehnica profilului ADN si acceptat in instanta in Anglia;

-1987 primul caz juridic rezolvat prin tehnica profilului ADN si acceptat in instanta in SUA.

ETAPE DE LABORATOR Sl METODOLOGIA DETERMINARII PROFILULUI ADN

Tehnologia profilului-tiparii ADN este deosebit de complexa. Ea necesita un laborator performant atat la nivelul echipamen-tului, cat si al calitatii personalului si se efectueaza dupa un protocol standardizat de desfasurare.

3.1. Materialul biologic necesar

Biochimistii si geneticienii au posibilitatea sa foloseasca ADN intact obtinut din produse biologice umane proaspete (frecvent sange, dar si ficat). in medicina legala acest lucru nu este decat rareori posibil (filiatie si unele delicte), cel mai adesea materialul de lucru fiind reprezentat de produse biologice umane uscate, aflate uneori in stare avansata de putrefactie, frecvent contaminate cu bacteriisau praf si nu in ultimul rand in cantitae mica.

Pe de alta parte, este demonstrat ca ADN-ul, spre deosebire de majoritatea antigenelor de grup sanguin folosite in identificarea serologica, se poate conserva si dupa mai multi ani dupa deces.

3.2. Extractia si purificarea ADN

Se realizeaza prin incubarea probei intr-o solutie care contine:

- detergent: Sodiumdodecilsulfat - SDS (determina liza nucleilor) +;

- proteinaza K (digestia proteinelor fixate pe ADN) +;

- dithiotreitol - DTT (reducerea gruparilor thiol si a celor sulfurice).

3.3. Clivarea dublului helix al ADN in fragmente

Se realizeaza folosind nuclee de restrictie care actioneaza precum un foarfece molecular, taind ADN-ul la nivelul unor secvente specifice de baze azotate (puncte fixe); ex.: Pst.1 folosita de Lifecodes Corporation este conceputa sa taie ADN ori de cate ori intalnesc secventa CTGCAG in cuprinsul intregului dublu helix.

Nucleazele de restrictie sunt fie naturale (produse de bacterii pentru a distruge ADN-ul vital, ex. Hinfl, Alu I, Hae III, Sau III), fie sintetice. De obicei sunt folosite nucleaze de restrictie naturale care recunosc o secventa de patru baze; daca bazele sunt dispuse intamplator atunci aceste enzime vor taia mereu la 4/4 bp = 256 pb; aceste enzime fiind bacteriene nu au situsuri de diva re pentru VNTR-ul uman, incat nucleaza va taia mereu numai de o parte si de alta a ministelitului, dar cu cat mai aproape cu atat mai specific.

Rezulta astfel milioane de fragmente de marimi diferite Fragmente de restrictie cu lungime polimorfa, RFLP (restrictiona fragment lenght polymorphisms).

O singura pereche de baze, diferita, intr-o anumita pozitie pe un anume cromozom poate elimina locusul de clivare al nucle-azei de restrictie si sa determine mari diferente in lungimea fragmentelor de restrictie ce rezulta din fragmentarea ADN-ului in cauza la pozitia respectiva.

Este esential de inteles ca un VNTR este mai mic decat un RFLP, iar un RFLP nu e obligatoriu sa contina un VNTR (poate contine insertii, deletii etc, deci nu neaparat repetitii tandemice).

3.4. Desfacerea ADN

Consta in desfacerea dublului helix in doua catene separate, prin tratare la peste 100 grade si in pH de minim 13.

3.5. Separarea fragmentelor

Fragmentele de ADN care au fost taiate pentru a forma RFLPs sunt separate prin electroforeza pulsata (schimbarea periodica a polaritatii electrice) in gel de agaroza (polizaharid izolat din plancton). Cu cat fragmentul este mai lung, cu atat migrarea sa este mai greoaie. Toate moleculele ADN poarta incarcatura negativa si deci vor migra catre polul pozitiv, formandu-se, in final, un pattern caracteristic. Sensibilitatea procedeului este fparte mare, ceea ce permite separarea fragmentelor de ADN chiar daca difera doar printr-un singur nucleotid.

3.6. Southern Blotting

Aceasta etapa consta in transferul fragmentelor de ADN pe hartie de nitroceluloza sau pe o membrana de nylon.

Hibridizare (renaturare)

Se aplica sonda ADN (DNA probe) pe membrana de nylon sau de nitroceluloza si se incubeaza mai mult timp la temperatura de 65C. Sonda consta intr-un segment de ADN recombinant (ADNc), reprezentat dintr-un fragment de ADN monolant sintetic (format din 15 mii nucleotizi), marcat radioactiv (32/P, care prin emiterea de radiatii permite autoradiografia), astfel sintetizat incat prin complementaritate sa se fixeze (hidridizare) pe un fragment ADN monolant din proba cercetata.

Aplicarea in continuare de nucleaze ce distrug tot ADN-ul nehibridizat va duce la obtinerea unor regiuni ADN hibridizate pure.

Lifecodes Corporation foloseste 4 tipuri de sonde ADN: D2S44, D14S1, D17S79 si DXYS14. 'D' inseamna ADN, '2,14, XY, etc.' defineste cromozomul ce va fi tintit, 'S' numarul de aplicatie cu care sonda se fixeaza pe aria cu polimorfism (VNTR-ul tinta).

Exista doua tipuri de tehnologie de profil-tipare- ADN:

- primul tip de tehnologie foloseste sonde ADN multi-locus (multi-locus probe) ce contin sonde pentru identificarea unui VNTR prezent in multiple locuri din genom. intrucat secventele repetitive sunt prezente in numar diferit la diferitii indivizi, nucleazele de restrictie vor taia fragmente de lungimi diferite si sonda ADN multi-locus recunoscand toate benzile derivate din aceste locusuri va produce un pattern ADN caracteristic.

- al doilea tip de tehnologie foloseste sonde ADN mono-locus (mono-locus ADN-probe) care identifica secventa centrala a unui minisatelit VNTR unica (gasita doar intr-un locus anume, pe o singura pereche de cromozomi omologi), si a devenit dupa cum prezentam la inceput tipul de sonda cu cea mai mare aplicabilitate in practica medico-legala.

in mod aparent, rezultatele obtinute prin aceasta metoda sunt mult mai simple decat in cazul sondelor multi-locus. Exista numeroase tipuri de sonde mono-locus sintetizate disponibile, corespunzand zonelor hipervariabile identificate in genomul uman, incat cercetarea amanuntita a acestora poate duce in final la rezultate la fel de valoroase ca in cazul celor multi-locus.

in general folosirea a trei sonde mono-locus este suficienta pentru a obtine o precizie similara folosirii unei sonde multi-locus.

Avantajele sondelor mono-locus sunt:

- timp mai scurt necesar analizei;

- utilizeaza cantitati mici de material biologic

- interpretare precisa, obiectiva, care permite formarea unei baze de date computerizate. Dezavantajele sondelor mono-locus:

- Excluderea unei persoane este certa, daca patternul suspectului si cel al probei sunt diferite, aici lucrurile sunt clare si rezultatul transant (pentru siguranta se considera ca daca exista doua diferente intre pattern-uri avem o excludere). Daca insa pat-tern-urile sunt asemanatoare, suspectul 'poate fi vinovat'; aceasta afirmatie trebuie completata cu precizarea probabilitatii acestei posibilitati: 'poate fi vinovat asa cum mai pot fi inca 100, 100.000 sau 1.000.000 de indivizi din populatia data'. Calculele statistice sunt mai complexe intrucat fiecare banda ADN are asociata o probabilitate diferita de aparitie in populatie.

3.8. Autoradiografie

Excesul de sonda ADN este spalat de pe membrana de nylon care apoi este plasata pe o bucata de film radiologie si expusa mai multe zile, apoi developat. Sondele multi-locus vor produce numeroase benzi intunecate la nivelul unei coloane albe pentru fiecare individ corespunzand la numeroase VNTR-uri cercetate pe numerosi cromozomi, in timp ce sondele mono-locus vor produce una sau doua benzi intunecate la nivelul unei coloane albe la fiecare individ corespunzand unei singure secvente VNTR provenite depe un singur cromozom omolog (o banda de pe cromozomul matern si una de pe cromozomul patern).

3.9. Tehnica PCR (Plymeraze Chain Reaction)

A doua revolutie care a avut loc in biologia medico-legala a fost inventarea tehnicii PCR (1985). inainte de digestia ADN cu nuclaze de restrictie se efectueaza repicarea minisatelitilor VNTR cu ajutorul unor primeri (oligonucleotizi sintetizati pentru a se potrivi cu secventele centrale ale VNTR-urilor ce se doresc a fi amplificate) in prezenta AND-polimerazei, si in mediu suturat de mononucleotide.

PCR ofera astfel posibilitatea utilizarii unor cantitati foarte mici de material biologic: o singura celula si p singura molecula de ADN fiind suficiente (de asemenea poate detecta si ARN pe care dupa prealabila transcriere in ADN cu revers-transcriptaza il poate folosi pentru amplificare).

Avantajele tehnicii PCR cuplata cu sonde mono-locus:

- viteza mare de lucru: de obicei maxim 24 ore fata de circa o saptamana cat este necesar pentru un profil ADN complet prin celelalte tehnici;

- costul redus per/analiza;

- posibilitatea automatizarii metodei;

- posibilitatea de colorare diferita a benzilor de origine materna de cele de origine paterna dintr-o pereche de benzi si usurinta identificarii fragmentelor caracteristice;

- permite analiza materialului biologic chiar atunci cand este disponibil in cantitati extrem de mici si este foarte vechi: exemplu oase de sute de ani vechime.

Dezavantaje:

- posibilitatea foarte usoara a contaminarii probei biologice de origine necunoscuta prin material genetic strain de aceasta: celule exfoliate de la personalul de laborator, ofiterul de politie etc. (pentru aceasta se iau masuri speciale de securitate a probelor printre care in mod obligatoriu pastrarea separata a materialului biologic de la locul faptei cu materialul biologic recoltat de la suspect);

- costul mare al echipamentului: 80.000 lire sterline;

- necesita crearea unor noi baze de date: rezultatele obtinute nu sunt compatibile cu cele prin tehnicile clasice mono si multi-locus. Tehnici PCR de ultima ora sunt tehnica MVR-PCR (Minisatellite variant repeat maping) ce utilizeaza variatia secventiei monoloce intre alelele locusului hipervariabil reprezentat de minisatelitul MS32 (locus D1S80), ceea ce ofera o inalta putere discriminatorie y21 si utilizarea sondelor ADN neizotopice prin tehnologia NICE (Non-lsothopic Chemiluminiscent Enhanced).

3.10. Interpretarea rezultatelor

Jeffreys a demonstrat o banda de distributie statistica de 0.25: astfel probabilitatea ca doi indivizi neinruditi sa prezinte exact acelasi pattern ADN este de 0.25/36 = 2 x 10/-22.

Se remarca in fig. 2 variatia imensa intre diferitii indivizi: in aceasta imagine caracteristica satelitilor multi-locus orice unica banda este gasita la 1 din 4 indivizi neinruditi (25%), doua benzi in 1 din 4 x 4 = 16 indivizi, trei benzi in 1 din 4 x 4 x 4 = 64 indivizi, etc. intrucat un profil ADN uzual contine 11 benzi, probabilitatea ca doi indivizi neinruditi sa aiba acelasi profil ADN este de 1 la 2,5 milioane indivizi.

Dupa cum a mai fost aratat, nu este intotdeauna posibil ca profilul ADN sa determine rezultate definitive in medicina legala: uneori materialul care se afla la dispozitia medicului legist duce la obtinerea doar a catorva benzi (posibil si acelea incomplete referitor la compozitia completa a unei secvente VNTR) prin lipsa materialului sau distrugerea in timp a acestuia. in mod uzual, in aceste cazuri bazate pe material biologic alterat sau vechi se poate dispune de 3-4 benzi: pentru 4 benzi probabilitatea ca profilul sa se potriveasca la 2 indivizi neinruditi este de 1 la 200. in cadrul interpretarii insa trebuie avut intotdeauna in consideratie cazul in speta si particularitatile sale; de exemplu, o probabilitate ca cea de mai sus poate fi suficienta pentru admisibilitatea probei in instanta in cazul in care colectivitatea posibila din care face parte criminalul numara mai putin de 200 indivizi!

Din acest punct de vedere, denumirea populara de 'amprenta ADN' care implicit presupune unicitate nu este intotdeauna conforma cu realitatea in cazul medicinii legale, motiv pentru care medicii legisti prefera denumirea de profil ADN (ADN profil-ing). in filiatie, acolo unde materialul ADN este intotdeauna proaspat, denumirea de amprenta ADN este mai potrivita.

O alta problema este desigur compararea cu bazele de date. O data ce se emit calcule de probabilitate, acestea presupun compararea cu o baza de date; din acest punct de vedere vor conta:

- marimea bazei de date (cu cat mai mare cu atat mai eficienta este comparatia);

- eterogenitatea ei (cu cat este mai eterogena cu atat mai eficienta comparatia); . " .

- probabilitatea de aparitie in populatie a benzii cercetate 3.11 Secventionarea ADN mitocondrial

Este ultimul test ca modernitate si complexitate in identificare.

Portiuni din ADN-ul mitocondrial sunt inalt variabile la indivizi neinruditi si deci secventionarea nucleotizilor acestuia permite identificarea si consecutiv deosebirea lor.

Aceasta tehnica este deosebit de utila in cazurile in care devine posibil medico-legal extragerea de material biologic provenit din fragmente subtiri de tulpina a firului de par, piele sau os provenite de la cadavre aflate in stare avansata de putrefactie.

in 1994 pentru prima data in Anglia o secventa de 800 baze din ADN-ul mitocondrial a fost extras din produsele biologice ale unui cadavru aflat in putrefactie avansata la circa 3 luni de la deces si care a probat aceeasi secventialitate cu cea a unicei sale rude aflate inca in viata, respectiv sora.

Lifecodes Corporation a fost pionierul tehnologiei ADN in SUA si este considerat cel mai experimentat laborator in acest domeniu. Lifecodes efectueaza cursuri de perfectionare si aprovizoneaza cu reactanti, enzime etc. numeroase laboratoare, inclusiv cel din FBI.

4. UTILIZAREA PROFILULUI ADN IN MEDICINA LEGALA

Folosirea actuala a profilului ADN in justitie consta in a demonstra ca, la o serie de locusuri VNTR, profilul suspectului se potriveste cu ADN-ul obtinut de la locul crimei.

Profilul ADN (amprenta ADN) este utilizat in medicina legala in domeniul filiatiei (unde probabil isi merita numele de amprenta genetica) si in criminalistica la cererea organelor in drept.

- Expertiza filiatiei

- Stabilirea identitatii urmelor biologice (petelor de sange, secretie vaginala, sperma, bulb pilos, fragmente de tesut)

- Identificarea speciei pentru diferentierea originii umane/animale

- Identificarea esantioanelor de sange prelevat pentru alcoolemie

- Identificarea resturilor cadaverice/scheletice

- Identificarea victimelor

- Confirmarea/infirmarea vinovatiei in delicte sexuale

- Confirmarea/infirmarea vinovatiei in omucideri

- Redeschiderea unor cazuri nesolutionate sau verificarea unor condamnari eronate

- Formarea unei banci de amprente genetice a delincventilor. 4.1. in filiatie

Tehnica se bazeaza pe faptul ca alelele fiecarui locus minisatelit sunt mostenite independent dupa sistemul Mendelian, astfel incat pe o pereche de cromozomi omologi, pentru acelasi locus, VNTR-ul provenit de la mama este diferit de VNTR-ul provenit de la tata, ceea ce permite nu numai identificarea individului dar si a parintilor sai. in plus, tehnica VNTR-PCR permite chiar posibilitatea de colorare a benzilor de origine materna de cele de origine paterna dintr-o pereche de benzi si usurinta identificarii fragmentelor caracteristice.

4.2. in criminalistica

4.2.1. Identificarea victimelor Caz istoric

Dec. 1987 Wichita: fostul sot - pornind de la un conflict juridic privind autoritatea paternala asupra copilului - dupa pronuntarea divortului ucide pe fosta sotie apoi, o incinereaza. Politia il surprinde tn posesia unei valize continand cenusa si unele resturi ce s-au devedit a fi umane, (Prof. William Eckert). Necunoscand ca sunt necesare 2-2,30 ore la temperatura de 1.500 grade pentru a incinera complet un cadavru, criminalul din graba a efectuat o incinerare incompleta; astfel in cuptorul crematoriului au fost gasite un inel si pete de sange, iar printre resturile arse identificate in valiza un fragment de alpinge, un fragment de femur cat si unele parti moi pelviene.

4.2.2. Confirmarea vinovatiei in delictele sexuale

Analiza ADN a fost cel mai frecvent utilizata in cazurile de viol: in acest caz proba medico-legala o reprezinta secretia vagi-nala: aceasta contine mari cantitati de ADN provenind de la nucleii celulari ai femeii, ceea ce tinde sa acopere benzile ADN provenite din nucleul spermatozoizilor.

intrucat spermatozoizii sunt acoperiti de un invelis proteic bogat in sulf, ei devin practic impermeabil la substante chimice ce au ca scop distrugerea ADN (detergenti). O data ce ADN-ul femeii a fost indepartat, ADN-ul spermatic poate fi solubilizat folosind substante chimice ce distrug rezistentul invelis proteic. Apoi profilul ADN obtinut va fi comparat cu profilul ADN al femeii in cauza pentru a demonstra ca ele sunt diferite si cu cel al suspectului.

Primul caz istoric in Anglia (1986)

in 1983 o fata a fost violata si ucisa in apropierea unui mic oras de langa Leicester. in 1986 o a doua fata a fost gasita in acelasi loc. Un barbat a fost arestat si acuzat de uciderea celei de-a doua fete dupa propria marturisire. Politia l-a considerat vinovat si de primul delict si a apelat la Jeffreys pentru a efectua profilul ADN. Profilul suspectului nu s-a potrivit cu sperma identificata de la cele doua cadavre: prin urmare a fost exonerat de ambele delicte. Testele au fost apoi reconfirmate prin analize succesive care au dus la aceleasi rezultate. A urmat cea mai mare vanatoare de suspecti din istoria politiei britanice (a fost analizata sperma tuturor celor 1.500 barbati locuitori din acea zona), dar initial fara rezultate pozitive. Catre sfarsitul perioadei, in urma unei banale discutii purtata intr-o institutie, a fost identificat un suspect caruia profilul ADN i s-a potrivit perfect cu cele doua esantioane de sperma de la cele doua cadavre, drept urmare fiind retinut si acuzat de dublu omor.

Confirmarea vinovatiei in omoruri Primul caz istoric in SUA(1987)

- Sept. 19,1987 Richmond Virginia; cadavru feminin de 35 ani gasit pe podeaua apartamentului propriu. Diagnostic medico-legal: Asfixie mecanica, viol.

- Oct. 3,1987 Richmond Virginia; cadavru feminin 32 ani gasit in WC-ul dormitorului de lanivelul 2 al propriei case. Asfixie mecanica.

Modus operandi: in ambele cazuri criminalul a intrat in casa catarandu-se pe zidul casei si taind un geam; in cazul primei victime o stranguleaza cu ciorapul strans de pompa de WC si viol; a fost gasita sperma pe pat. in cazul celei de-a doua victime stranguleaza cu o curea si viol cu perversiuni sexuale (sodomie); sperma a fost gasita pe chilotul victimei. Ambele victime aveau mainile legate la spate.

- Nov. 22,1987 Chesterfield County (la sud de Richmond, in vecinatate); cadavrul unei tinere de 15 ani e gasit in apartamentul parintilor.

Modus operandi; criminalul a intrat pe geam pe cand familia dorwa. Victima a fost strangulata, a fost legata cu mainile la spate si violata.

- Dec. 1, 1987 Airlington Conty (Nothem Virginia); cadavrul unei femei de 44 ani a fost gasit in patul din dormitorul de la nivelul 2 al casei sale.

Modus operandi: Strangulata si violata; se identifica sperma pe camasa de noapte, (in acea perioada profilul ADN era considerat un experiment de laborator neadmis in justitie).

S-a inceput cu cercetarea modusului operandi in omorurile prezentate si o ancheta completa despre toate delictele grave in acea zona, a fost identificat un omor in 1984 dar la care autorul era retinut. Au fost identificate in 1983 violuri neurmate de deces: produselor biologice retinute cu acea ocazie li s-a efectuat profilul genetic dovedindu-se ca acesta era comun la toate aceste violuri si identic cu profilul ADN efectuat din sperma identificata in omorul de la Airlington.

Pe parcursul anchetei se desprinde ca suspect un anume Spencer Timothy care a fost inchis in 1983 pentru alte tipuri de delicte decat cele prezentate pana acum si apoi eliberat in acelasi an.

Ofiterul insarcinat cu ancheta banuieste ca acesta este autorul violurilor din 1983, a crimei din 1984, cat si a celorlalte crime.

in ian. 20,1988 se decide arestarea lui Spencer initial pentru omorul de la Airlington. Efectueaza profilul ADN lui Spencer care corespunde cu profilul ADN al probei de sperma de la Airlington si apoi verifica pe rand toate celelalte violuri si crime dovedint similaritatea profilului ADN in toate omorurile inclusiv in cel din 1984; pentru omorul din Chesterfield a fost necesara tehnica PCR (proba biologica era in cantitate redusa); in consecinta justitia pune in libertate si repune in drepturi pe detinutul retinut pentru omorul din 1984.

S-a considerat in aceste cazuri ca profilul ADN a fost 'semnatura crimei' pentru Spencer.

La apelul de la Curtea Suprema de Justitie Spencer este gasit vinovat pe baza marturiei a doua dintre victimele violate si neucisein 1983.

4.2.4. Redeschiderea unor cazurinesoluponate

intrucat ADN isi mentine pentru mult timp integritatea in specimenele uscate, Se pot redeschide cazuri vechi la care se dispune in conservare de probe biologice. intr-un studiu efectuat in perioada iunie 1995-iunie 1996, Departamentul de Justitie al SUAa analizat cazurile a 26 persoane judecate si condamnate pentru delicte sexuale/delicte sexuale + crima, care au fost exonerate de vina in urma investigarii retroactive ADN. Aceste persoane, condamnate pe nedrept, au efectuat intre 9 luni si 11 ani din pedeapsa (7 ani in medie). Condamnarea s-a bazat pe identificarea vizuala efectuata de victima/martori si demonstrarea similitudinii prin metode non-ADN intre suspect si urmele biologice gasite la fata locului sau pe corpul victimei.

4.2.5. Formarea bazei de date de amprenta genetica a delincvenplor si criminalilor

La primul delict fiecare delincvent are inregistrate amprentele papilare si amprenta genetica, ce vor folosi in identificarea sa ulterioara intr-un delict fie anterior in care nu a putut fi acuzat sau care a ramas cu autor neidentificat, fie intr-unui viitor.

Anglia este prima tara din lume care in 1995 a infiintat baza nationala de date ADN ce numara astazi circa 0,5 milioane profiluri ADN; cercetarea in aceasta baza de date a 3 benzi rezultate prin tehnica sondelor mono-locus nu a permis pana acum nici o suprapunere, intrucat cercetarea cu o singura sonda ADN genereaza o probabilitate de suprapunere de 1:100, cercetarea cu doua sonde de 1:10.000 si cercetarea cu trei sonde de 1:1.000.000 de indivizi.

Puterea profilului ADN sta tocmai in potentialul sau discriminatoriu: de aici si posibilitatea formarii de baze de date ale delincventilor, ce permite legarea intre ele a delictelor produse in locuri si momente diferite scutind numeroase eforturi si forte politienesti.

4.2.6. Infirmarea vinovatiei

Circa 30% din suspecti sunt exonerati in Anglia de diverse delicte prin aceasta tehnica.

5. ADMISIBILITATEA PROBEI PROFILULUI ADN IN JUSTITIE:

Bazele de date

Valoarea si utilitatea in justitie a amprentei genetice ca proba de certitudine a fost intens studiata in ultimii ani si ea se poate exprima prin asezarea standardelor legale ale admisibilitatii in general si a criteriilor admisibilitatii ca proba in instanta a profilului ADN.

Standardele legale ale admisibilitatii au fost definite in SUA cu ocazia procesului Freye contra Stat SUA.

Freye v. USA: 'Momentul in care un principiu stiintific sau o anume descoperire trece limita dintre experiment si posibilitatea practica de demonstratie este dificil de stabilit. Ea va putea fi folosita in justitie ca marturie expertala in momentul in care a capatat accept general in domeniul stiintific din care face parte'.

in ceea ce priveste admisibilitatea in justitie a profilului ADN ea recunoaste drept criterii validarea metodei de lucru si a laboratorului in care se efectueaza tehnica cat si tipul si marimea bazei de date folosita pentru comparatie.

Standardizarea europeana actuala are ca scop tocmai monoformitate internationala de tehnologie si tehnica intr-o tehnologie care evolueaza foarte rapid. Grupul European pe Profil ADN (European DNA Profiling Group, EDNAP, 1989) are ca scop tocma standardizarea tehnicii si acreditatrea internationala a laboratoarelor dupa criteriile tehnologice si ale calitatii rezultatelor.

6. VALOAREA Sl LIMITELE PROFILULUI ADN IN MEDICINA LEGALA Sl JUSTITIE

Controverse si critici

in multe tari amprenta ADN a devenit un instrument larg folosit in practica medico-legala, fiind admisa ca proba in justitie; mai mult decat atat, datorita perceptiei acesteia ca tehnica infailibila, multe cazuri implicand amprenta ADN sunt aduse in fata Curtii cu putine alte dovezi incriminante.

Entuziasmul initial a fost temperat in ultimul timp de numeroasele controverse si critici, ceea ce a determinat constituirea in mai multe tari a unor comisii stiintifice care sa investigheze criticile aduse amprentei ADN, ca de exemplu cea condusa de National Research Concuil a US National Academy of Sciences, care s-a materializat in 1992 intr-un raport asupra 'Tehnologiei ADN in medicina Legala'.

Controversele si criticile aduse amprentei ADN pot fi clasificate in mai multe categorii:

A Principii de baza

Diferitele tipuri de secvente tandemice repetitive de ADN sunt dispersate abundent in genomurile practic tuturor speciilor eukariote. Unii autori considera ca atat timp cat informatiile priviotare ia secventele repetitive de ADN non-uman sunt extrem de sarace, principiului amprentei ADN nu i se poate acorda incredere mai ales pentru identificare.

B. Tehnici de laborator

Procedurile de laborator sunt puse adesea la indoiala mai ales deoarece diferite laboratoare pot obtine diferite rezultate cand analizeaza acelasi esantion.

Cu toate ca analiza VNTR-urilor prin tehnica PCR permite o determinare precisa a lungimii alelelor, aceste secvente repeti-

vive pot avea valori extreme de variabilitate secventiala care pot fi determinate numai prin secventializare sau MVR (analiza variantei minisatelitilpr repetitivi).

Variatii flagrante ale independentei alelelor pot apare datorita unor binecunoscute fenomene electroforetice determinate de proprietatile fizice ale locusurilor VNTR.

Multe exemple includ cazuri in care 'artefacte experimentale' sunt invocate pentru a explica elementele neconvenabile care apar in autoradiografii, acele cazuri in care se declara o concordanta intre ADN-ul suspectului si ADN-ul probei in ciuda prezentei unor benzi neconcordante, ca si cazurile in care s-au realizat mai multe profiluri ADN din care cel mai convingator este prezentat ca proba in justitie.

Astfel este cazul deja celebru al lui Andrew Deen care a fost declarat de curand nevinovat si achitat dupa ce in 1990 a fost condamnat la 16 ani inchisoare pentru viol, la dosarul sau singura dovada de condamnare a acestuia fiind potrivirea ADN-ului sau cu ADN-ul gasit la locul faptei. Datele ADN ale lui Deen erau bazate mai mult pe alele multi-locus decat pe alele cu locus unic. Medicii legisti britanici au numarat 10 benzi de identitate (sau potrivire - 'matching bands'), calculand o probabilitate de potrivire ('match probability) de 1700.000. La apelul final facut in instanta, un medic legist german desemnat pentru reexaminare a sustinut ca dupa parerea sa sunt de fapt doar 6 benzi de potrivire, 4 neutre si 2 discrepante, ceea ce duce in final la o probabilitate de potrivire de 1:33, si deci de nevinovatie, intrucat probabilitatea este foarte mica si alte date nu exista la dosar.

Un alt punct disputat este riscul mare de contaminare a probei cu ADN 'strain' (contaminarea se poate produce in orice stadiu de la prelevare si pana la tehnicile de laborator) care poate interfera puternic rezultatele. Contaminarea poate fi de origine bacteriana si de asemenea, mult mai periculos pentru rezultatul investigatiei, de origine umana. Pentru tehnica PCR riscul de contaminare este mult mai mare decat in cazul tehnicilor conventionale, astfel cea mai mare calitate a tehnicii PCR (faptul ca necesita numai cantitati foarte mici de ADN) reprezinta cea mai importanta sursa de eroare. O privire elocventa asupra valoriii informative, eficientei discriminatorii si garantiei obiectivitatii amprentei ADN (HLa - DQalfa) in cazurile medico-legale de rutina, o furnizeaza un studiu statistic, din care rezulta ca numai in 70% din cazuri s-a putut realiza amplificarea PCR, din care in numai 42% s-au putut obtine informatii relevante privind excluderea/acuzarea unui suspect (aceasta limitare s-a datorat in principal faptului ca materialul biologic supus analizei nu provenea de fapt de la agresor, ci de la victima sau de la alte persoane). Astfel, din 10.060 investigatii ADN efectuate de FBI pana in iunie 1996, 20% au fost neconcludente, 20% au permis excluderea si in 60% din cazuri s-a constatat o potrivire intre proba si suspect.

Procesarea de laborator si interpretarea profilului ADN, oricat de riguroase ar fi, depind intr-o masura foarte mare de modul de obtinere a probelor si a informatiilor legate de acestea: de exemplu, in cazul unui delict sexual, daca in fluidul vaginal exista mai multe tipuri genetice de sperma provenite de la 2 sau mai multi indivizi diferiti, cu care femeia a avut contact sexual recent, exista posibilitatea ca investigatia de laborator sa puna in evidenta profilul ADN al altei persoane si nu al violatorului, caz in care suspectul este exonerat pe baza fortei de convingere a amprentei ADN.

C. Controverse generate de interpretarea rezultatelor

Excluderea unei persoane (exonerare de suspiciunea de vinovatie a unui suspect) este certa daca pattemul suspectului si cel al probei sunt diferite, aici lucrurile fiind clare si rezultatul transant (pentru siguranta se considera ca daca exista doua diferente intre pattern-uri avem o excludere). Daca insa pattern-urile sunt asemanatoare suspectul 'poate fi vinovat'; aceasta afirmatie trebuie completata cu precizarea probabilitatii acestei posibilitati: 'poate fi vinovat., asa cum mai pot fi inca 1, 100.000 sau 10.000.000 de indivizi'. Calculele statistice sunt mai complexe intrucat fiecare banda ADN are asociata o probabilitate diferita de aparitie intr-o anumita populatie, grup sau subgrup etnic.

Dupa American Association of Blood Banks, urmatoarele criterii ar trebui intrunite de expertizele ADN pentru ca acestea sa fie admisibile:

1. Locusurile ADN investigate trebuiesc validate prin studii familiale pentru a demonstra ca acestea se transmit rnendelian si au o anumita rata de mutatii;

2. Localizarea cromozomiala a locusurilor polimorfe trebuie sa fie inregistrata in Yale Gene Library sau recunoscuta de International Human Gene Mapping Workshop;

Locusurile polimorfe trebuie sa fie documentate in literatura;

4. Tipul de polimorfism folosit trebuie definit din punct de vedere al caracterului uni/multilocular, sau dialelic/hipervariabil;

5. Esantioanele trebuie sa fie disponibile pentru testari de confirmare in laboratoare independente.

D. Controverse legate de analiza bazei de date populaponale

Deoarece populatiile umane nu sunt omogene (existand diferente semnificative in ceea ce priveste frecventa unor alele VNTR nu numai intre principalele grupuri rasiale, dar si in cadrul substructurilor acestora), datele acumulate pana in prezent nu permit generalizari fiabile in ceea ce priveste frecventa alelelor in subpopulatii/grupuri etnice, relevante pentru un caz anume. Problema ar fi simplificata daca s-ar cunoaste apriori ca vinovatul si suspectul fac parte din acelasi grup etnic.

Probabilitatile calculate pe baza unor colectari heterogene de date pot deci subestima adevaratele probabilitati cu pana la doua ordine de marime.

in viitor frecventele plafon vor trebui stabilite pe baza unei baze de date mai adecvate, mai bogate, cuprinzand locusuri relevante de la subpopulatii multiple.

Modul in care probabilitatile asociate cu profilele ADN sunt prezentate cu profilele ADN sunt prezentate in justitie este de asemenea criticat de unii specialisti in genetica populationala, o metoda sugerata pentru a reduce riscul de condamnare a unui suspect, la nivelul actual al cunostintelor in domeniul amprentei AND, consta in exprimarea probabilitatii unei potriviri ca proportia in care genotipul multilocus a fost osbservat in populatia generala;

E. ontroverse in ceea ce priveste calculul proba bilitaplor

O problema teoretica importanta, adesea ignorata, este ca probabilitatea ca un individ sa aiba un anume profil ADN este diferita (frecvent mai mica) de probabilitatea ca el sa aiba chiar profilul ADN al suspectului. Ultima dintre aceste probabilitati este cea vitala pentru medicina legala. Diferenta dintre cele doua probabilitati poate fi foarte mare: pentru un profil ADN calculat pe 4 VNTR cu o probabilitate neconditionata de 1/10.000.000, probabilitatea de potrivire conditionata pentru un frate al suspectului va fi de obicei mai mare de 1/100, in timp ce pentru un alt membru al grupului populational din care face parte suspectul poate fi 1/10.000 sau mai mare.

Daca doua profiluri ADN se considera ca se potrivesc, relevanta acestei probe este sustinuta de ceea ce se numeste "probabilitate de potrivire', adica probabilitatea ca la o persoana neinrudita aleasa intamplator dintr-o populatie reprezentativa sa i se potriveasca profilul ADN cu profilul ADN al probei cercetate de la fata locului. Modul de calculare al acestei probabilitati a fost mult dezbatut de catre Lewontin si Hartl) dar putine s-au spus despre corecta sa interpretare. Exista doua aspecte importante si total diferite intre ele in ceea ce priveste interpretarea profilului ADN; acestea se exprima prin doua intrebari:

1) care este probabilitatea ca la un individ nevinovat sa aiba loc potrivirea secventelor sale cu ale probei? - adica probabilitatea de potrivire ca o persoana aleasa la intamplare sa aiba acelasi profil ADN cu proba.

2) care este probabilitatea ca un individ sa fie nevinovat desi secventele sale se potrivesc cu cele ale probei? - adica probabilitatea de nevinovatie.

La prima intrebare raspunsul este dat de probabilitatea de potrivire; a doua intrebare insa este cea mai importanta pentru justitie In dubio pro reo. Cele doua intrebari sunt foarte diferite si cer raspunsuri diferite: frecvent juratii pot gresi dand raspunsul la prima intrebare prin intermediul celei de-a doua (aspect numit "sofismul procurorului' - prosecutor's fallacy -) sau invers, fapt ce determina confuzie prin confundarea probabilitatii de potrivire cu cea a probabilitatea de nevinovatie.

Trebuie remarcat ca o mica probabilitate de potrivire, nu poate prin ea insasi sa determine vinovatia. Cand avem de-a face cu probabilitati de potrivire extrem de mici pare naiv sa se ignore posibilitatea unui rezultat fals pozitiv datorat unei greseli omenesti. O afirmatie bazata pe probabilitati este prin natura ei o afirmatie de cunoastere partiala, de aceea este paradoxal sa transformam aceasta cunoastere intr-o dovada certa, care poate duce la privarea de libertate sau chiar executia unui individ.

F. Valoarea metodei

in ciuda acestor controverse, progresele recente in domeniul profilului ADN au transformat acest tip de investigatie intr-un instrument de investigatie de o importanta deosebita pentru medicina legala datorita unor calitati incontestabile.

- metoda are o specificitate si o capacitate de discriminare net superioara metodelor clasice de identificare serologica;

- permite identificarea urmelor biologice chiar daca acestea se gasesc in cantitati infinitezimale (de ordinul a 60 nonagrame la cativa nucleotizi);

- se poate aplica cu succes chiar atunci cand urmele biologice sunt foarte vechi si degradate (situatii in care markerii sero-logici obisnuiti sunt inutilizabili).

in administrarea justitiei, aportul profilului ADN il constituie exonerarea de vinovatie al suspectilor si evitarea sau repararea comiterii unor erori judiciare.

G. Concluzii

Introducerea tiparii ADN a reprezentat o revolutie in domeniul biologiei moleculare. De la descoperirea amprentelor papilare, profilul ADN reprezinta cea mai mare descoperire in domeniul criminalistic si este indisolubil legata de viitorul medicinii legale. Din controversele actuale rezulta necesitatile evolutive care determina directiile viitoare de dezvoltare a tehnologiei ADN:

/. Crearea unei banci internationala de date ADN pentru uz medico-legal, conectata cu banci de date similare; este necesara datorita fluxului de informatii in permanenta crestere si necesitatii de acces in timp real la aceste date.

//. Programe de cercetare coordonate pe plan international. Din motive evidente de eficienta, cercetarile ar trebui sa se desfasoare dupa un program international, concentrandu-se asupra unor prioritati, ca de exemplu detectia si studiul proprietatilor locusurilor hipervariabile, studii populationale asupra frecventei alelice etc.

///. Ameliorarea tehnicii ADN. Evolutia rapida in tehnologia ADN, inregistrata in ultimul deceniu, ar trebui si trebuie sa se continue catre ameliorarea tehnicilor de extractie, de detectie si filtrare a ADN-ului contaminant, de crestere4 a fiabilitatii tehnicilor ADN (automatizare, interpretare computerizata etc).

IV. Standardizarea tehnicilor de laborator. Deoarece fiabilitatea tehnicilor ADN a fost pusa la indoiala datorita diversitatii actuale de procedee si tehnici de laborator, este necesar un efort international indreptat catre standardizarea procedurilor de laborator.

7. PROBLEME ETICE Sl JURIDICE

Cunoasterea patrimoniului genetic va deveni din ce in ce mai profunda si deci va aduce din ce in ce mai multe informatii asupra identificarii individului, asupra predispozitiei sale catre anumite maladii genetice, asupra potentialei manipulari a geno-

mului sau aceste noi cunostinte vor fi redutabile pe plan social, daca foarte repede nu vor fi comitete nationale de etica pentru orice tine de genetica si biotennologie, comitete ce trebuie sa defineasca de o maniera stricta limitele utilizarii sondelor genetice.

in medicina legala problemele sunt in principal de trei categorii:

- protectia si respectarea individului; este posibil spre exemplu de a decide alegerea unor regiuni cu inalt polimorfism ADN care nu aduc nici o informatie asupra sanatatii persoanei;

- crearea multifisier central;

- problema filiatiei.

Aceste aspecte sunt diferite de problemele ridicate, spre exemplu, de amprentele digitale care au dat suficient timp de gandire marelui public, in timp ce rapiditatea aparitiei noilor tehnologii ADN nu lasa suficient timp de intelegere a ansamblului problemelor specifice stiintelor medico-legale, implicand riscul de a confunda posibilitatile manipularii fiintei umane si a descifrarii polimorfismului individual, probleme cu mare impact atat in dreptul penal cat si in cel civil.

- se pune astfel problema acceptului la prelevare de probe

- in filiatie admiterea incontestabilitatii probei

- introducerea de norme de acreditare pentru laboratoarele specializate, fiecare laborator acreditat trebuind sa asigure prin personal calificat o munca de calitate cu rezultate reproductive.

Numai in astfel de conditii in care rezultatele sunt exacte, fiabile si reproductibile, exista sansa combaterii eficiente a criminalitatii internationale.

Capacitatea amprentei ADN de a "stabili' vinovatia sau nevinovatia a capatat atentia si entuziasmul politiei si justitiei. Terminologia si tehnologia sofisticata, futurista a tehnicilor ADN, Ie-a inconjurat cu o aura de infailibilitate ceea ce a determinat existenta multor cazuri implicand amprenta ADN, care au fost aduse in fata Curtii cu putine alte dovezi incriminante. Pentru moment nici instantele nici magistratii nu sunt pregatiti sa inteleaga pe deplin valoarea dovezilor rezultate din tehnicile ADN, deci nu pot lua decizii corecte bazate pe argumentele controversate aduse de expertii apararii si acuzarii. Aceasta explica neincrederea cu care au inceput sa fie privite dovezile ADN de catre tribunale in ultimul timp. Contrastand cu procesul obisnuit al progresului stiintific, se observa in prezent tendinta ca medicii legisti sa se cantoneze in pareri inflexibile, rigide datorita unor marturii depuse anterior. Un sistem adversial bazat pe contradictorialitate nu este recomandabil dezvoltarii acestui camp nou de activitate medico-legala, si in general progresului stiintific medico-legal (vezi cazul Deen), intrucat fixeaza rigid legistii intr-o mentalitate de asediu ("siege mentality') care ii determina sa refuze noi evidente de frica posibilelor lor implicatii penale. Cu toate ca natura interogativa a sistemului adversial poate afecta acuratetea de exprimare, argumentul ca juriul ar fi putut ajunge la acelasi verdict chiar daca dovezile ADN ar fi fost corect prezentate ridica serioase probleme.

Unele din erorile judiciare dovedite in Marea Britanie au implicat cercetatori care au ascuns anumite detalii ale rezultatelor investigatiilor lor. Poate ca la fel de nelinistitoare este si posibilitatea ca juriul sa fi putut ajunge la aceeasi concluzie si fara dovada ADN. Influentati de publicitatea exagerata facuta amprentei ADN, juratii pot interpreta probabilitatile mici legate de dovezile ADN ca o dovada irefutabila de vinovatie, netinand seama de alte probe. Cei care prezinta astfel de dovezi trebuie sa se asigure ca pericolul de interpretare eronata este explicat cu grija juriului. Problema daca acuzatul este sursa esantionului gasit la fata locului depinde de tehnologia ADN dar si de celelalte dovezi prezente la dosar. Aprecierea acestora este o problema primordiala; in consecinta nu este corect ca un expert sa-si exprime opinia in ceea ce priveste vinovatia acuzatului. Cu toate ca poate parea natural ca omul de stiinta care efectueaza un test sa-si poata exprima opinia daca esantionul gasit la fata locului provine de la acuzat sau nu, aceasta conceptie este totusi eronata.