Replicare

Slide 11. Replicarea la E. Coli este initiata de catre proteina DnaA

Secventele de 9 si 13 pb sunt secvente repetitive din figura anterioara. Mai multe copii ale proteinei DnaA se leaga la secventa de 9 pb din orfigine si apoi "topeste" (sepqara catenele) segventei de 13 pb. Singura functie a DnaC este de aelibera DnaB, care este compusa din 6 subunitati identice cu matrita. Un hexamer DnaB se fixeaza pe fiecare catena ADN la nivelul oriC, formand un complex de promar. DnaB este o helicaza, iar cele doua molecule se vor orienta in cele doua directii diferite ale furcii de replicare indepartandu-se de origine.

Slide 12. La E. coli DnaB helicaza este responsabila de desfacerea duplexului ADN

In prezenta ATP si a SSB (single strand binding protein) DnaB purificata poate desface (desfasura) duplexul ADN in vitro. Desfacerea apare predominant in directia capatului 3 al catenei la care este atasata molecula DnaB. Aceasta catena actioneaza ca matrita pentru sinteza catenei intarziate (lagging strand). Proteinele SSB se leaga la catenele de ADN desfacute pentru a impiedica reasocierea. Pentru simplificare, legarea DnaB la catena complementara din partea dreapta nu este luata in considerare.

Slide 18: Procesivitatea ADN polimerazelor creste datorita prezentei subunitatii dimere b "clamp"

Subunitatea beta dimera a ADN polimerazei III, creste procesivitatea enzimei.

a)Modelul spatial al legarii subunitatii la ADN dedus ca urmarea a studiilor cristalografice cu raze X privind legarea subunitatii bata la ADN. Cele doua subunitati (rosie si galbena) formeaza o structura sub forma unui inel (agrafe) care ramane intim legata circular la molecula de ADN, dar care se desprinde la capetele ADN linear.

b) Diagrama schematica a asocierii propuse pentru "core" ADN polimeraza III (verde) cu subunitatea beta clama (croseta) de la capatul primerului Aceasta interactie tine structura "core" impiedicand-o sa alunece pe matrita si permitandu-i sa ramana la nivelul punctului la care se adauga nucleotidele, crescand procesivitatea structurii "core" mai mult de o mie de ori.

Slide 19: Sinteza catenei continue si discontinue este concurenta

O DnaB helicaza se deplaseaza de-a lungul matritei catenei lagging catre capatul sau 3' , determinand astfel desfacerea duplexului ADN la nivelul furcii.

2)O "core" polimeraza (core 1) adauga rapid nucleotide la capatul 3' al catenei leading si la nivelul matritei sale monocatene nu se afla o DnaB care sa isi manifeste activitatea sa helicazica. Aceasta subunitate polimerazica ramane legata la ADN impreuna cu subunitatea sa beta, sintetizand astfel continuu catena leading.

3)O a doua polimeraza "core 2" sintetizeaza catena lagging discontinuu sub forma unor fragmente Okazaki. Cele doua polimeraze "core" sunt legate prin intermediul unei proteine dimere t (teta). Deoarece nu intreaga matrita monocatenara a catenei lagging nu este acoperita pe ea se fixeaza protein SSB si formeaza o bucla. Dupa ce sinteza fragmentelor Okasaki este completa, polimeraza de pe catena lagging disociaza de pe ADN dar rimane legata de subunitatea dimerului t. Structura "core" eliberata se refixeaza cu ajutorul unei alte subunitati beta in regiunea unui nou primer pentru a sintetiza un alt fragment Okazaki.

Slide 20: Masinaria de replicare eucariota este "in general" similara cu cea de la E. coli

Modelul replicarii in vitro a SV40 de catre enzimele sistemului eucariot

Figura contine atat cresterea furcii de replicare cat si formarea originii SV40: catena de sus este catena leading pentru furca care se deplaseaza catre stanga, iar catena de jos este catena leading pentru furca care se deplaseaza in dreapta. Initierea incepe prin legarea antigenului T (Tag) si a altor proteine la nivelul originii de replicare (1), care induc desfacerea structurii dublu-catenare. Aceasta este urmata de legarea unei forme hexamere a Tag la matrita catenei leading pentru fiecare furca de replicare. 2) Functionand ca o helicaza fiecare structura hexamera a Tag se deplaseaza de-a lungul catenei la cere s-a legat catre capatul 5' , desfacand structura dublu catenara; astfel Tag helicaza si DnaB se deplaseaza in directii opuse de-a lungul ADN . Polimeraza alfa (pol alfa) , care este strans asociata cu o primaza formeaza capatul 5' al catenelor leading (3) si apoi este transferata de pe matrita (4). Asocierea polimerazei d (Pol d cu PCNA creste procesivitatea acestei polimeraze, astfel incat aceasta poate sintetiza restul de catene leading (5). Sinteza catelelor lagging este realizata prin actiunea combinata a a primazei si a Pol a (alfa). RFC stimuleaza activitatea Pol a

RPA= Replication Protein A

RFC= Replication Factor C

PCNA= Proliferating Cell Nuclear Antigen

Model of an SV40 DNA replication fork and assembled proteins. (a) A hexamer of large T-antigen ( 1 ), a viral protein, functions as a helicase to unwind the parental DNA strands. Single-strand regions of the parental template unwound by large T-antigen are bound by multiple copies of the heterotrimeric protein RPA ( 2 ). The leading strand is synthesized by a complex of DNA polymerase (Pol ), PCNA, and Rfc ( 3 ). Primers for lagging-strand synthesis (red, RNA; light blue, DNA) are synthesized by a complex of DNA polymerase (Pol ) and primase (4 ). The 3end of each primer synthesized by Pol-primase is then bound by a PCNA-Rfc-Pol complex, which proceeds to extend the primer and synthesize most of each Okazaki fragment (5 ). See the text for details. (b) The three subunits of PCNA, shown in different colors, form a circular structure with a central hole through which double-stranded DNA passes. A diagram of DNA is shown in the center of a ribbon model of the PCNA trimer. (c) The large subunit of RPA contains two domains that bind single-stranded DNA. On the left, the two DNA-binding domains of RPA are shown perpendicular to the DNA backbone (white backbone with blue bases). Note that the single DNA strand is extended with the bases exposed, an opti-mal conformation for replication by a DNA polymerase. On the right, the view is down the length of the single DNA strand, re-vealing how RPA strands wrap around the DNA. [Part (a) adapted from S. J. Flint et al., 2000, Virology: Molecular Biology, Pathogenesis, and Control, ASM Press; part (b) after J. M. Gulbis et al., 1996, Cell 87:297; and part (c) after A. Bochkarev et al., 1997, Nature 385:176.]

Electron microscopy of replicating SV40 DNA indicates bidirectional growth of DNA strands from an origin. The replicating viral DNA from SV40- infected cells was cut by the restriction enzyme EcoRI, which recognizes one site in the circular DNA. Electron micrographs of treated samples showed a collection of cut molecules with increasingly longer replication "bubbles," whose centers are a constant distance from each end of the cut molecules. This finding is consistent with chain growth in two directions from a common origin located at the center of a bubble, as illustrated in the corresponding diagrams. [See G. C. Fareed et al., 1972, J. Virol. 10:484; photographs courtesy of N. P. Salzman.]

Slide 23. Activitatea de "proofreading" a ADN polimerazei corecteaza erorile de copiere

Demonstratie experimentala a functiei de editare a ADN polimerazei I de la E. Coli.

Au fost construiti : o matrita artificiala Poli(dA) si un primer corespunzator marcat cu timidina tritiata. Complexul matrita-primer a fost incubat cu ADN polimeraza I purificata. In prezenta timidinei trifosfat pppT s-a constatat o pierdere foarte rapida citidinei marcata cu P si retinerea intregii radiaoactivitati a timidinei tritiate. Aceasta indica ca enzima inlatura numai C terminal incorect adaugand in acelasi timp mai multe resturi de T complementare cu matrita. In absenta pppT, atat timidina tritiata cat si citidina marcata cu P32 sunt inlaturate. Aceasta indica ca in lipsa pppT pentru a realiza activitate de polimerizare, enzima isi manifesta activitatea 3'-5' exonucleazica fiind astfel inlaturate bazele corecte.

Slide 24. Telomeraza previne scurtarea catenelor intarziate in timpul replicarii eucariotelor

Mecanismul de actiune al telomerazei

Aceast complex ribonucleoproteic alungeste capetele telomerice 3' ale matritei ADN a catenei lagging printr-un mecanism de revers-transcriptie. In figura este vorba de activitatea telomerazica a enzimei din Oxytricha, care adauga unitati repetitive T4G4; alte polimeraze pot adauga secvente de marimi diferite.

Telomeraza contine o matrita ARN (rosu) care se imperecheaza la capatul 3' al matritei catenei lagging. Situsul catalitic activ al telomerazei (verde) adauga apoi deoxiribonucleotide (albastru) folosind molecula de ARN drept matrita; aceasta revers-transcriptie incepe cu pozitia 35 a matritei ARN (Pasul 1). Catenele duplexului ADN-ARN rezultat se pare ca aluneca apoi una in raport cu cealalta conducand la deplasarea unei regiuni monocatenare catre catena de ADN telomera si la descoperirea partiala a secventei ARN matrita (pasul 2). Secventa telomerica a catenei intarziate este apoi extinsa catre pozitia 35 de catre telomeraza si duplexul ADN-ARN sufera translocari si hibridizare ca si in etapele anterioare (pasii 3 si 4). Se pare ca mecanismul de alun ecare este usurat de imperecheri neobisnuite (punctele negre) care apar intre resturile G care sunt mult mai putin stabile decat imperecherile Watson-Crick. Astfel, telomerazele pot adauga structuri lungi repetitive prin reluarea aetapelor mai sus prezentate (pasul 4 si 5).

Slide 40: Carcinogeni chimici care actioneaza asupra ADN direct sau dupa activare

Carcinogenii cu actiune directa sunt compusi inalt electrofili care interactioneaza direct cu ADN

Carcinogenii indirecti trebuiesc metabolizati inainte de a reactiona cu ADN. Toate aceste substante chimice reactioneaza ca mutageni.

Capacitatea mutagena a majoritatii compusilor a fost demonstrata majoritoar prin experiente realizate pe sisteme bacteriene. Deoarece potentialul mutagen este adesea proportional cu potentialul carcinogen, mutageneza bacteriana reprezinta teste de baza pentru testarea carcinogenilor.

Primul si cel mai popular test este testul Ames, numit astfel dupa Bruce Ames cel care l-a pus la punct. In una dintre versiunile testului, compusul chimic este incubat cu mai intai cu un extract de ficat pentru a permite aparitia oricarui tip de activare. Si apoi este adaugat unei culturi bacteriene pentru a detecta tipurile specifice de mutatii.

Problema este ca testul Ames poate evidentia produsii cu potential carcinogen dar de cele mai multe ori nu se pot demonstra mecanismele de inducere a acestora.

Cea mai buna dovada a faptului ca substantele carcinogene actioneaza ca mutageni provin din obsrvatiile ca ADN celular este modificat (alterat) in urma expunerii celulelor in cultura la acestea si posibila transformare in celule de tip canceros.

Exemplu: extras ADN din celule umane in cultura expuse la actiunea unui carcinogen sau din tumori de colon. Acest ADN este pus in contact cu fibroblaste 3T3 de soarece cultivate in monostrat. Se constata o hiperproliferare a acestora. Analiza ADN din aceste celule 3T3 transformate oncogenic demonstreaza ca majoritatea acestora au integrat un segment de ADN uman care continea una sau mai multe mutatii la nivelul unei gene celulare normale, numite proto-oncogene, implicate in controlul cresterii si diviziunii celulare. Exprimarea acestei gene mutante umane determina proliferarea anormala a fibroblastelor 3T3. Formele mutante ale proto-oncogenelor care determina o proliferare anormala a celulelor sunt numite oncogene.

Astfel, au fost identificate mutatiile de la nivelul proto-oncogenei ras, gena cu un important rol in aparitia cancerului de colon.

Slide 41: Dezaminarea bazelor conduce la formarea sponatana a mutatiilor punctiforme

Pe langa activitatea de proof-reading a ARN polimerazei care corecteaza neimperecherile induse in timpul replicarii, celulele au dezvoltat o serie de mecanisme pentru repararea alterarilor din structura ADN cauzate de produse chimice si radiatii.

In organismele complexe cu genoame mari exista multe tipuri celulare care care se divid incet sau deloc (celule hepatice, neuronale, etc). Astfel de celule folosesc informatia din structura ADN saptamani, luni sau chiar ani, crescand sansele mentinerii alterarilor in structura ADN. Daca procesele de reparare lucreaza cu o eficienta de 100% aceste neajunsuri sunt depasite. Din nefericire, repararea leziunilor cauzate de agenti de mediu este destul de ineficienta si aceste leziuni pot conduce la aparitia de mutatii care in final pot duce la aparitia cancerului. Teoretic, un carginogen poatre actiona legandu-se la ADN si determinand o modificare a secventei care este perpetuata in timpul replicarii.

Mecanismele de reparare au fost studiate mai intens la E. coli, folosind o combinatie de abordi genetice si biochimice. Datorita diversitatii mecanismelor de reparare acetea pot fi impartite in trei categorii:

- mecanisme de reparare a neimperecherilor, care apar imediat dupa sinteza ADN, foloisind catena parentala drept matrita pentrui a corecta nucleotidul incorect incorporat in catena nou sintetizata;

- mecanisme de excizie si reparare care inlocuiesc regiunile afectate din structura ADN cu ajutorul unui sistem nucleazic specializat si apoi umplerea "gap-urilor";

- repararea breselor dublu-catenare care apar la organismele multicelulare prin procese de sure (legare) a capetelor (end-joining process).

Repararea neimperecherilor punctiforme (Mismatch repair of Single-Base Mispairs)

Figura: Formarea mutatiilor punctiforme spontane prin dezaminarea citozinei (C) pentru a forma uracil (U)

Dupa dezaminarea citozinei (C) care conduce la formarea U, daca nu se reuseste restaurarea imperecherii normale C-G prin mecanisme de reparare, mutatia va fi fixata in timpul replicarii. Dupa un ciclu de replicare, o moleculi fiica va fi purtatoarea mutatiei U-A si cealalta va apartine tipului salbatic. Uracilul este inlaturat si inlocuit cu timina generand un ADN mutant in care perechea T-A inlocuieste perechea C-G.

Multe mutatii spontane sunt punctiforme, fiind implicata o singura baza din structura ADN. Acestea pot aparea in urma procesului de replicare sau particular prin procese de dezaminare unde un rest de C se transforma intr-o timina ca in figura de mai sus. Sitemele bactetiene si eucariote poseda un sistem de recunoastere si reparare a neimperecherilor punctiforme, cu exceptia neimperecherilor C-C, ca si a insertiilor si deletiilor mici.

Problema conceptuala a cu reparatiile punctiforme este determinarea catenei normale si a celei mutante, si repararea acesteia din urma pentru imperecherea corecta cu catena normala.

Slide 42: Repararea imperecherilor nepotrivite la nivelul unui defect punctiform

Mecanismul de actiune al repararii mutatiilor punctiforme a fost elucidat in urma descoperirii sitemului MutHLS de la E. coli.

Astfel, la E. Coli, resturile de adenina din secbventa GATC sunt metilate la novelul pozitiei 6. Pe catena nou formata aceste resturi de adenina nu sunt metilate urmind a fi metilate de catre o enzima specifica numita Dam metilaza, care actioneaza numai la cateva minute dupa sinteza. In timpul acestei perioade de lag, ADN nou replicat este hemi-metilat la nivelul secventelor GATC.

In acest interval o proteina numita MutH   se poate lega specic la catenele hemi-metilate, fiind capabili sa distinga intre catena parentala si cea nou sintetizata. Astfel, orice eroare de imperechere aparuta in timpul replicarii care determina aparitia unei neimperecheri va fi identificata de catre alta proteina numita MutS care va determina legarea MutL, o proteina care conecteaza MutH cu MutS si determina clivarea secventei de catre MutH. Dupa excizia initiala, segmentul de pe catena fiica este excizat si inlocuit cu secventa ADN corecta.

La tulpinile de E. coli mutante pentru sistemul MutHLS, proteinele prezinta o rata mare de mutatii spontane fata de tipul salbatec. De asemenea tulpinile care nu pot sintetiza Dam metilaze au si ele o rata ridicata de mutatii spontane. Deoarece tulpinile Dam nu pot metila adeninele din structuta GATC, sistemul de reparare MutHLS nu pot distinge intre catena parentali si cea nou sintetizata.

Un mecanism similar de reparare a leziunilor rezultate din depurinare, pierderea unei guanine sau adenine din structura ADN rezultand din clivarea legaturilor glicozidice dintre dezoxiriboze si baze. Depurinarea apare spontan si este destul de comuna la mamifere. Siturile apurinice rezultate, daca raman nereparate, genereaza mutatii in timpul replicarii ADN deoarece acestea nu pot specifica baza pereche. Toate celulele poseda endonucleaze apurinice (AP) care taie catena ADN in apropierea situsului apurinic. Ca si in cazul repararii neimperecherilor punctiforme, taietura este extinsa de catre exonucleaze, si distanta lipsa este reparata de catre ADN polimeraza si ligaza.

Figura: Model de reparare a neimperecherilor de catre sistemul MutHLS de la E. Coli

Sistemele de reparare opereaza adesea dupa incorporarea unei baze gresite, inainte de metilarea catenei nou formate. MutH se leaga specific la secventa hemimetilata GATC, si MutS se leaga la situsul de neimperechere. Legarea proteinei MutLsimultan cu MutS si in proximiktatea MutH activeaza activitatea endonucleazica a MutH, care apoi taie catena nemetilata la nivelul secventei GATC . Regiunea de pe catena fiica care contine neimperecherea este excizata (inlaturata). In continuare se repara defectul (se umple gaura) de catre ADN polimeraza I, se produce ligarea si metilarea secventei fiice reparata.

Slide 43: Baze modificate chimic: dimeri timina-timina

Celulele folosesc repararea prin excizie pentru a fixa regiunile de ADN care contin baze chimic modificate, adesea numite aducti chimici, care distorsioneaza copmportamentul local normal al ADN. Cheia acestui tip de reparare o reprezinta capacitatea anumitor proteine de a aluneca de-a lungul moleculei de ADN dublu-catenare cautand o protuberanta sau iregularitati in structura dublului helix. De exemplu, acest mecanism repara dimerii de timina-timina, cea mai comun tip de modificare cauzata de razele UV. Acesti dimeri interfera atat cu replicarea cat si cu transcriptia. Mecanismele de excizie-reparare pot corecta si regiunile care contin baze alterate prin atasarea unor grupari chimice mari (cum sunt carcinogenii ca benzopirenul).

Probabil cel mai bine inteles mecanism de excizie-reparare UvrABC de la E. coli. Celulele cu mutatii la nivelul locusurilor uvrA, B, C sunt foarte sensibile la UV si compusi chimici care adauga grupari mari la structura ADN.

Slide 44: Mecanismul UvrABC de excizie-repair a ADN la E. coli

Figura : Doua molecule de UvrA si una de UvrB formeaza un complex care se deplaseaza aleator de-a lungul ADN (etapele 1 si 2). Daca complexul intalneste o leziune conformationala la nivelul ADN, denatureaza local dublul helix ADN si in indoie la 130 , folosind energia furnizata de hidroliza ATP (etapa 3). Dupa ce dimerul UvrA disociaza (etapa 4), endonucleaza UvrC se leaga si taie (inlatura) intreaga catena afectata la nivelul a duoa situsuri separate de 12 sau 13 pb (etapele 5 si 6). In continuare, UvrB si UvrC disociaza si helicaza II inlatura definitiv regiunea afectata (etapa 7), fragmentul monocatenar fiind degradat in mononucleotide. Bresa este umpluta de ADN polimeraza I si ligarea este realizata de ADN ligaza (etapa 8).

Figura ilustreaza cum sistemul UvrABC repara modificarile din structura ADN. Initial, un complex care contine doua molecule de UvrA si o molecula de UvrB se cupleaza si apoi se leaga la ADN. Atat formarea cat si legarea la ADN necesita ATP. Se pare ca complexul UvrA-UvrB se leaga initial la un segment neafectat si sufera o translocare de-a lungul helixului ADN pana cand este recunoscut aductul; aceasta translocare de-a lungul helixului necesita si ea ATP. O modificare conformationala ATP-dependenta la nivelul regiunii ADN se leaga la complexul UvrA-UvrB si apoi produce o indoitura, rasucitura la nivelul sitului afectat. Dupa disocierea dimerului UvrA, proteina UvrC care are si activitate endonucleazica se leaga la situl afectat. Interactia dintre UvrC si indoitura din structura ADN determina deschiderea catenei si permite sitului cxatalitic al enzimei sa aiba acces la tinta sa. Poziotionarea precisa a sitului de clivare este determinata de natura problemei de la nivelul ADN. In cazul dimerilor de timina, UvrC cliveaza doua legaturi fosfodiester: una este localizata la opt nucleotide catre 5' fata de leziune, si una este localizata la 4 sau 5 nucleotide in 3' fata de leziune. Dupa ce UvrC cliveaza regiunea afectata aceasta este indepartata de catre o helicaza si degradata; regiunea lipsa este reparata cu participarea ADN polimerazei I si ADN ligazei.

Slide 45: Repararea capetelor ADN neomolog

Figura : Repararea breselor dublu-catenare prin unirea capetelor ADN ne-omolog (in albasxtru deschis si inchis), adica, cu secvente ne-similare la capete.

Aceste tipuri de ADN pot fi fragmente ale aceleiasi gene, sau fragmente de ADN de pe diferiti cromozomi. Un complex din doua proteine, Ku si o protein-kinaza ADN dependenta, se leaga la capetele pauzei bicatenare. Dupa formarea unei sinapse la nivelul careia capetele rupte se suprapun, Ku inlatura capetele, pana cand are sansa detectarii de secvente omologe pe cele doua catene ADN care se vor imperechia in regiunea de microomologie. Capetele monocatenare 5' neimperechiate sunt inlaturate prin mecanisme care nu sunt destul de bine cunoscute, iar cele doua molecule dublu-catenare sunt ligate impreuna. Drept rezultat, pauza dublu catenara este reparata dar o serie de baze de la nivelul situsurilor de legare sunt indepartate.

Repararea capetelor ADN neomolog

O celula care a suferit o rupere particulara a capetelor dublu-catenare contine de obicei si alte rupturi; fiecare ruptura poate fi reparata prin unirea capetelor libera ale ADN. Unirea capetelor rupte care apartin la diferiti cromozomi duce adesea la translocari ale unor fragmente de ADN de pe un cromozom pe altul. Aceste translocari pot conduce la o cresttere anormala a celulelor prin plasarea unei proto-oncogene dupa sau in apropierea regiunii control al unui promotor apartinand altei gene.

ruperile dublu-catenare pot fi cauzate de radiatii ionizante si de medicamente anticanceroase, cum sunt bleomicina (reprezinta calea prin care acesti compusi omoara celulele in crestere)

Ruperile dublu-catenare pot fi corect reparate numai daca capetele libere ale ADN se reunesc exact. O astfel de reparare este complicata prin absenta regiunilor monocatenare care se pot imperechea direct in timpul procesului de unire. Unul din cele doua mecanisme implicate in repararea rupturilor dublu-catenare o reprezinta recombinarea omologa. In acest proces, rupturile dublu-catenare de pe un cromozom sunt reparate folosind informatia de pe cromozomul omolog intact.

Totusi, la organismele multicelulare, mecanismul predominant de reparare a dublelor catene rupte implica reunirea capetelor a doua molecule de ADN. Molecula obtinuta va paierde un numar de baze la nivelul regiunii de reunire a celor doua catene. Formarea unei astfel de deletii mutagene este un exemplu de modalitate de introducere de mutatii prin procesul de reparare. Un proces similar poate aduce impreuna oricare doua molecule de ADN, chiar si acelea care prfovin de la cromozomi diferiti.

Slide 46: Eucariotele au sisteme de reparare a ADN analoge cu cele de la E. coli

Este evident ca mecanismele de reparare ale ADN au fost conservate de-a lungul evolutiei. De exemplu, studii biochimice recente demonstreaza ca celulele umane poseda mecanisme similare de repararea neimperecherilor similare cu cele de la E. Coli. Procesul de reparare poate fi initiat de proteina Muta, un omolog al MutS bacterian, care se leaga atat la bazele neimperechiate cat si la micile insertii sau deletii, sau prin MutSb, care leaga in principal insertiile si deletiile. Proteina umana MutL recrutata in structura de legare a ADN de catre MutSa si MutSb, dar identitatea nucleazei umane (echivalenta MutH de la E. Coli) care scindeaza ADN, nu este cunoscuta. Dupa clivarea, care apare fie in 3' fie in 5' fata de neimperechere, o exonucleaza indeparteaza 100 la 200 nucleotide anlaturand neimperecherea. ADN polimeraza d este principala responsabila pentru umplerea bresei iar ligarea este realizata de catre ADN ligaza.

Studiile genetice realizate pe sisteme eucariote care se intind de la drojdii la om sugereaza ca mecanisme similare de excizie-reparatie sunt folosite de diferite organisme. Strategia de baza este determinarea de mutanti care manifesta o crestere a sensibilitatii la UV si l alti agenti care determina leziuni ADN. Astfel de mutanti se presupune ca sunt deficienti in mecanismele normale de excizie-reparare. La drojdii (S. Cerevisiae) exista, de exemplu genele radiosensibile (RAD). Prin folosirea unor tehnici de inginerie genetica au fost generati mutanti de linii celulare CHO (Chinese Hamster Ovary) care prezinta o sensibilitate anormala la UV sau la mitomicina C, care formeaza aducti ADN voluminosi. Aceste mutatii se pot imparti in opt grupuri de complementare, sugerand ca cel putin 8 gene diferite sunt implicate in procesul de excizie reparare la hamster.

Experimentele de transfectie au evidentiat ca anumite gene umane pot sa "ssalveze" anumite celule mutante CHO UV sensibile. Doua dintre genele umane evidentiate in acest mod s-a demonstrat ca sunt inrudite cu genele RAD3 si RAD10 de la drojdii. Proteinele umane care reprezinta omologie partiala cu proteina RAD10 contin, de asemenea, o regiune care este similara cu o parte a UvrC de la E. Coli.

Remarcabil, cinci polipeptide necesare pentru procesele de excizie-reparare din celulele eucariote, incluzand doua care prezinta omologie cu helicazele, sunt si ele subunitati ale TFIH, un factor general de transcriptie necesar ARN polimerazei II. Se pare ca natura foloseste proteine similare de asamblare in doua procese celulare diferite care necesita activitate helicazica. Folosirea subunitatilor citate mai sus in procesul de transcriptie si de reaparare a ADN, pot explica cuplarea transcriptiei cu repararea. Acest fenomen este observat in cazul indepartarii alterarilor de la eucariotele superioare care se fac cu o viteza mult mai mare in cazul regiunilor intens transcrise in comparatie cu cele ne-transcrise (sa ne reamintim ca numai o mica proportie din genele eucariotelor superioare sunt transcrise activ in orice celula).

Slide 47: Sistemele inductibile de reparare a ADN predispozitie spre erori

Cand celulele sufera foarte multe alterari la nivelul ADN, dupa un timp scurt sistemele de reparare sunt saturate, apare pericolul pastrarii unui numar foarte mare de leziuni care vor fi perpetuate. In astfel de situatii, atat sistemele bacteriene cat si celulele animale pot folosi sisteme de reparea inductibile. Astfel de sisteme nu sunt exprimate in celulele normale sau in cele care sufera un numar scazut de mutatii.

Unul dintre aceste sisteme este sistemul de reparare SOS de la bacterii. Deoarece acest sistem genereaza, la randul lui multe erori in repararea leziunilor ADN, spunem ca acesta furnizeaza o anumita predispouitie la erori (error-prone). Sistemul SOS, care repara leziunile create de UV difera de sistemul constitutiv UvrABC discutat anterior prin faptul ca activitatea sa este este independenta de proteina RecA care este implicata si in procesul de recombinare neomologa.

Erorile induse de sistemul SOS apar la nivelul regiunii lezate, sugerand ca mecanismul de reparare duce la insertia aleatoare de nucleotide in locul celor afectate. Acest sistem este folosit numai in ultima instanta. Bacteriile carora le lipseste sistemmul SOS de excizie-reparare pastreaza mutatiile provocate de UV si de agenti chimici dar in acelasi timp rata mutatiilor nu este foarte crescuta.

Celulele animale poseda sisteme de reparare inductibile, dar nu se cunoaste daca acestea determina o anumita predispozitie la introducerea de erori. Totusi, asa cum am vazut mai inainte principalul mecanism de reparare a fragmentelor dublu catenare rupte determina inducerea de erori. Astfel, repararea structurilor bicatenare, sistemele de reparare care determina predispozitie spre erori joac<a, cu siguranta un rol foarte important in procesul de mutageneza si astfel in carcinogeneza animala. In orice caz, multi cercetatori considera ca multe dintre mutatiile care apar si se pastreaza in structura ADN sunt mai degraba consecinta alterarilor indirecte decat directe asupra ADN.

Deaorece alterarile din structura ADN determinate de radiatii sau de agenti carcinogeni trebujie reparate inainte de replicare deoarece celulele poseda mecanisme care vor sesiza alterarile si vor stopa replicarea. Aceste mecanisme care vor constitui subiectul altor discutii implica un punct de control reprezentat de proteina p53, care action eaza pentru a stopa ciclul celular daca ADN este alterat, impiedicand dezvoltarea tumorilort. Celulele care nu exprima p53 functionala manifesta proportii mari de mutatii si se constata accelerarea formarii tumorilor.

Slide 49: Prezentare (1)

Recombinarea omologa apare in timpul meiozei in organismele cu reproducere sexuala. Fiecare cromozom omolog patern si matern reprezinta o combinatie de diferite alele. Prin generarea de noi cromozomi care contin parti din fiecare omolog parental si maternal, recombinarea va avea drept rezultat o noua combinatie de alele pentru un anumit cromozom. Astfel recombinarea furnizeaza un mecanism de generare a diversitatii genetice obtinuta prin segregare independenta a cromozomilor. Schimburi genetice prin recombinare apar nu numai la animale si plante dar si la procariote, virusuri plasmide si chiar ADN din organite cum este mitocondria.

Evenimentele recombinarii reciproce sunt echivalente cu o rupere a doua molecule duplex ADN omologe, un schimb intre cele doua catene la nivelul rupturii, si rezolvarea celor doua duplexuri fara probleme. De obicei, recombinarea apare aleator antre doua segmente de ADN omologe, astfel frecventa de recombinare intre doua situri fiind proportionala cu distanta dintre acestea.